实验概要
本实验用原位杂交法测定了TNF的mRNA。
主要试剂
1. 原位杂交
1) TNF-DNA探针
2) 地高辛标记液试剂盒
3) 杂交液:60%去离子甲酰胺,300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2PO4(pH7.4),5%葡聚糖硫酸酯,250μg/μl变性鲑精DNA
2. 洗涤
1) 2×SSC:1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7NA3·2H2O,分子量294)8.8g
2) 0.5×SSC:300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可
3) 0.2×SSC:270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可
3. 荧光抗体检测
1) 封闭液:Tris-HCl 100mmol/L PH7.5,NaCl 150mmol/L,0.5%羊血清。
2) 抗DIG-荧光素抗体
3) 洗涤液:0.1M,pH7.2~7.4PBS。
4) 20%甘油:20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
5) 乙醇:70% 90% 100%
6) 防退色溶液:九份甘油与一份染液(1mmol/L Tris-HCl pH7.5,2% 1.4-diaza-bicyclo[2,2,2]-Octane,500ng/ml propidiumiodide)
7) 地高辛标记和检测试剂盒
主要设备
1. 原位杂交
温箱,水浴锅,加样器,吸头,染色缸等
2. 荧光抗体检测
加样器,吸头,染色缸等
实验步骤
1. 原位杂交
1) 用地高辛标记DNA探针;
2) 准备杂交液;
3) 临用前,将DIG标记的DNA探针在80℃加热10分钟,迅速置冰浴中变性后,将其加入杂交液中,至终浓度5μg/μl;
4) 将10-20μl杂交混合液(杂交液加变性探针)加入到固定并增加了通透性的细胞上,盖上专用原位杂交盖玻片,放入盛有约20ml 20%甘油湿盒内37℃使其杂交过液。
2. 洗涤
揭掉盖玻片,30-37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次,0.5×SSC洗涤15min×1次,0.2×SSC洗涤15min×1次。
3. 荧光抗体检测
1) 每块载玻中上加100μl封闭液,封闭非特异性结合位点;
2) 用封闭液将抗DIG-荧光素抗体按1:500稀释加在载玻片上,置湿盒内37℃温育45min,用洗涤液洗5min×4次;
3) 用100mol/L Tris-HCl(pH7.5),150mmol/L NaCl,0.05% Tween 20洗载玻片;
4) 将细胞样品依次在70%,90%,100%乙醇浸泡5分钟,脱水;
5) 将玻片在空气中干燥;
6) 将细胞样品放在防退色溶液中,取出封片。