实验概要
本实验在成功构建了表达Cip蛋白的重组酿酒酵母的基础上,对其应用于Panagrellus redivivus线虫的生物测定进行了探讨,并与重组大肠杆菌比对。
主要试剂
1. 主要试剂
1) 蛋白胨(Peptone),广州环凯微生物科技有限公司;
2) 尿嘧啶(Uracil),AMRESCO进口分装,上海生工;
3) 胆固醇(Cholesterol),AMRESCO进口分装,上海生工;
其他试剂为国产分析纯。
2. 培养基和常用溶液
1) NGM(Nematode Growth Medium)培养基
NaCl 3 g
Peptone 2.5 g
H2O to 1 L
如配制固体培养基,还需加入1.7%琼脂粉。高压灭菌50 min后,待培养基冷却至55℃,依次加入下列试剂:
CaCl2(1 mol/L) 1 mL
Uracil(2 mg/mL) 1 mL
Cholesterol(10 mg/mL) 0.5 mL
磷酸钾缓冲液(1 mol/L,pH 6.0) 25 mL
MgSO4(1 mol/L) 1 mL
小心混匀后,倒平板,注意不要引入气泡,NGM平板可在4℃保存数周。配制液体NGM则待完全冷却后,依次加入上述试剂。
2) M9缓冲液
Na2HPO4 6 g
KH2PO4 3 g
NaCl 5 g
MgSO4·7H2O 0.25 g
以双蒸水定容至1000 mL,高压灭菌50 min,室温保存。
3) 0.1%硫柳汞,称取0.1 g硫柳汞溶于100 mL双蒸水中,细菌过滤器过滤除菌,4℃保存。
4) 1 mol/L CaCl2溶液,称取无水CaCl2 11.1 g,溶于100 mL双蒸水中,高压灭菌20 min,保存于4℃。
5) 2 mg/mL尿嘧啶(Uracil),准确称取尿嘧啶100 mg溶于50 mL双蒸水中,细菌过滤器过滤除菌,4℃保存。
6) 10 mg/mL胆固醇(Cholesterol),确称取胆固醇0.5 g溶于50 mL无水乙醇中,4℃保存。
7) 1 mol/L磷酸钾缓冲液(1 mol/L K2HPO4,1 mol/L KH2PO4,pH 6.0),分别配制2 mol/L K2HPO4及2 mol/L KH2PO4溶液,准确量取12.3 mL K2HPO4溶液与87.7 mL KH2PO4溶液,与80 mL双蒸水充分混匀,测定溶液的pH值,如有必要微调至6.0,以水定容至200 mL,高压灭菌20 min,4℃保存。
8) 1 mol/L MgSO4溶液,称取MgSO4·7H2O 24.647 g,溶于80 mL双蒸水,定容至100 mL,高压灭菌20 min,保存于4℃。
主要设备
1. 24孔及96孔细胞培养板,美国Corning公司;
2. XSZ-D2型倒置显微镜,重庆光学仪器厂;
3. Leitz020-435.025光学显微镜,德国ERNST LEITZ WETZLAR GMBH;
4. 40倍双目解剖镜,日本Nikon;
5. 细菌过滤器(0.2 µm孔径),美国Pall公司。
实验材料
1. 大肠杆菌Escherichia coli OP50;
2. 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1;
3. 重组酿酒酵母INVSc1/pYES2.1/V5-His-TOPO-cipA、INVSc1/pYES2.1/V5-His-TOPO-cipB;
4. 海洋线虫Panagrellus redivivus。
实验步骤
1. 菌株的培养
1) 大肠杆菌的培养
在LB(50 µg/mL Car)培养基中培养基因工程菌BL21(DE3)/pET-15b-cipA、BL21(DE3)/pET-15b-cipB、BL21(DE3)/pET-15b至对数生长期,将菌液均分为两份,一份中加入IPTG溶液(终浓度为1 mmol/L),另一份不加,37℃继续培养8~12 h。
2) 酿酒酵母的培养
对携带有cipA或cipB基因的重组酿酒酵母,挑取直径2 mm左右的单菌落,挑取SC-U(2%葡萄糖)平板上重组酵母单菌落,接种于15 mL SC-U(2%葡萄糖)中,250 r/min、30℃培养过夜;测定菌液OD600值,分别吸取2 mL菌液,离心(1500 g,4℃,5 min),将细胞沉淀以无菌SC-U(2%半乳糖)培养基洗涤一次,分别重悬于10 mL无菌SC-U(2%半乳糖)和10 mL无菌SC-U(2%葡萄糖)中,250 r/min、30℃分别培养18 h、12 h;
对酿酒酵母INVSc1,于YPD液体培养基中培养12 h即可。
2. 线虫的制备
1) 线虫的培养
A. 按照2%的接种量,接种E. coli OP50 100 µL于5 mL LB培养基中,37℃,200 r/min振荡培养24 h;
B. 吸取培养OP50菌液0.1 mL,滴加至NGM平板上,无菌刮棒平铺后,37℃倒置培养24 h;
C. 将线虫种接入培养有OP50菌株的NGM平板上,置于25℃。
2) 无菌J1线虫的获得
A. 查看NGM平板上雌虫的形成情况和怀卵情况,一般培养42 h后大部分雌虫都有发育成熟的卵;
B. 超净工作台上,收集怀卵雌虫,用无菌针头将怀卵雌虫挑至装有无菌M9缓冲液的培养皿中;
C. 以无菌M9缓冲液清洗收集的线虫三次:吸取M9缓冲液到培养皿中,混合均匀,使线虫悬浮并与液体充分接触,待线虫自然沉降后,用移液器将缓冲液吸走;
D. 加入0.1%硫柳汞,使怀卵雌虫充分悬浮,置于25℃,50~70 r/min体表消毒半小时;
E. 挑10条左右上述处理后的怀卵雌虫,置于培养皿中,加入200 µL无菌M9缓冲液;
F. 解剖镜下,用无菌针头将虫体刺破,待卵自然漂浮离体后,将虫体移开;
G. 选取漂浮的单颗分离的卵,用无菌200 µL吸头吸至加有无菌M9缓冲液的24孔细胞培养板上,每孔100~150颗卵;
H. 以无菌M9缓冲液清洗收集的卵2次,清洗后,待卵自然沉降,解剖镜下吸走液体,小心不要吸走卵;
I. 加入400 µL无菌NGM液体培养基,置于25℃,50~70 r/min缓摇过夜,观察是否有细菌生长,以及卵的恢复情况;
J. 2~3天后,如果没有杂菌生长,由卵所孵化出的J1幼虫即可视为无菌幼虫,可以用于后续的实验操作。
3. 重组大肠杆菌-海洋线虫培养系统的建立
以无菌Panagrellus redivivus J1幼虫为目标线虫,按照以下方法建立液体测定系统:
1) 生物测定前,测定各待测菌液的OD600值,如有必要,以无菌LB(50 µg/mL Car)液体稀释各菌液至相等的OD600值,待用;
2) 在24孔细胞培养板上,分别加入各待测菌液(包括诱导和未诱导的),每孔250 µL,以无菌LB(50 µg/mL Car)为空白对照,每个处理设三个重复;
3) 每孔中加入15条J1线虫,以parafilm膜封口;
4) 25℃下,将培养板置于水平摇床上缓摇培养(70 r/min),每24 h检查线虫生长、繁殖及死亡情况。
4. 重组酿酒酵母—海洋线虫培养系统的建立
以无菌Panagrellus redivivus J1幼虫为目标线虫,按照以下方法建立液体测定系统:
1) 对各培养菌液,离心获得细胞沉淀,以无菌NGM洗涤沉淀一次,然后重悬于无菌NGM液体中。以无菌NGM培养基为空白对照,调整细胞悬浮液的OD600值,使之均为2.5;
2) 在24孔细胞培养板上,分别加入培养的酵母细胞悬液(包括诱导和未诱导的)及对照悬浮液,每孔250 µL,以无菌NGM液体为空白对照,每个处理设三个重复;
3) 每孔中加入10~15条J1线虫,以parafilm膜封口;
4) 25℃下,将培养板置于水平摇床上缓摇培养(70 r/min),每24 h检查线虫生长、繁殖及死亡情况。
5. 镜检与数据分析
倒置显微镜及体视镜下,检查幼虫生长发育情况、雌雄虫形成、雌虫怀卵量、繁殖情况、各种虫态的死亡情况以及第二代线虫的形成情况。
数据以百分数形式表示,经平方根反正弦转化后,以SPSS 11.5 软件进行统计分析。本文中,除明确说明外,生物测定的平均数据以“平均数±标准误(SE)”表示,方差分析采用邓肯氏新复差检验法(Duncan’s Multiple Ranger Test,DMRT)。