促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, thyrotropin, TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素, 由α和β2个亚基组成, 相对分子质量(Mr)为28000[1]。TSH本身受下丘脑分泌的TSH释放激素TRH的调控, TSH的主要生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌, 血液中甲状腺激素水平与腺垂体分泌TSH的量之间有负反馈抑制关系[2]。甲状腺功能改变时, TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显, 是反映下丘脑垂体甲状腺轴功能的敏感指标, 因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法, 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒, 与国内外同类产品相比具有简便、 快捷、 成本低等优点。
1 材料和方法
1.1 材料 TSH单克隆抗体(mAb)、 TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶（HRP）为Sigma公司产品, 光免板为Thermo Electron公司产品, 化学发光底物为BioRad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 标准品的配制 将TSH抗原标定后溶于小牛血清中, 配制成含0.1, 1, 5, 20, 100 mIU/L的标准溶液。
1.2.2 抗体包被板的制备 将100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中, 37℃包被2 h, 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液于37℃封闭2 h后晾干备用。
1.2.3 酶标记物的制备 TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备, 然后经0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析过夜后, 加入等量的甘油于-20℃保存备用。
1.2.4 检测方法 将50 μL待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中, 37℃温育30 min, 弃反应液, 用洗涤液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液）洗5次, 加酶标记物50 μL, 37℃温育30 min后同样用洗涤液洗5次, 然后加入发光底物于5～10 min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。
2 结果
2.1 动力学性质 在HRP鲁米诺H2O2发光体系中, 将不同量的免疫复合物加入发光液中, 发光强度（RLU）随反应时间而变化。10 min后RLU接近峰值, 在5～15 min内RLU较为稳定, 随后开始缓慢下降。
2.2 反应条件优化
2.2.1 加样量对RLU的影响 样本和酶标记物的加样量分别为50 μL和100 μL考查标准品（0、 0.1、 1、 5、 20、 100 mIU/L）RLU, 发现加样量为100 μL与50 μL RLU相差不大, 说明50 μL的加样量反应能达到平衡(图1)。
图1 加样量对RLU的影响（略）
2.2.2 反应模式对RLU的影响 采用二步法。第一步: 加入标准品和待测样品后, 将反应体系在37℃分别温育15、 30、 45、 60 min; 第二步: 加入酶标记抗体后, 将反应体系在37℃分别温育15、 30、 45、 60 min。结果表明温育时间为30 min时反应皆能达到平衡(图2)。
图2 温育时间对RLU的影响（略）
A: 第一步温育时间对RLU的影响; B: 第二步温育时间对RLU的影响.
2.3 稳定性 将试剂盒放置于37℃ 6 d后, 比较与放置前参考标准品各点RLU值, 参考标准品各点RLU值未见明显降低, 且本底发光值无明显升高, 表明试剂盒标准曲线无明显漂移, 满足稳定性要求。
2.4 方法学评价
2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下, 以标准血清的浓度（0～100 mIU/L）制作的标准曲线见图3。同时测定20个零标准, 用零标准均值加上2倍标准差, 计算出此方法的灵敏度为0.0788 mIU/L。
图3 TSH标准曲线（略）
2.4.2 精密度 取低(4.44 mIU/L)、 中(19.45 mIU/L)和高(79.23 mIU/
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