实验步骤 |
一 材料与设备
1) 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1),
2) 乙醚
3)2.5mol/LKAc
4) 乙醇
5)DEPC 处理水
6)TBE 缓冲液
7〕上样液:40% 甘油,0.4% 啡叮溴红的 TBE 溶液
S) 透析袋
9)KCI
二 操作方法
1. 酚:氯仿:异戊酵提取法
1) 蔗糖密度梯度离心纯化的病毒与等体积饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 混合,冰浴中振荡 3〜5 min。
2) 在 4℃ 下,8000 g 离心 lOmin,吸出上层水相,再用同样方法处理第二次,获得的上层水相用乙醚洗涤;二次去酚,水相加 1/10◦体积的 2.5mol/LKAc 及 2 倍体积乙醇,在—20℃ 下保存
2. 琼脂糖凝胶制备电泳纯化法
1) 制备 1.2% 琼脂糖-TBE 凝胶。
2) 在离心去乙醇的 RNA 小管中,加入 40〜80ul 电泳上样液,上样进行电泳。电泳液为 TBE,电 60〜100V, 电泳 3〜6 h
3)
切下含病毒 RMA 区带的凝胶条,装入透析袋,内加 0.5〜2 mlTBE,
袋的两端用线或普通木夹或塑料夹)封口,放在电泳槽中再次进行电泳。约 lh 后 RMA 走出凝胶,吸出袋内 RNA, 加 KC1 至
0.25mol/L,加 2 倍体积乙醇,在一下保存。
3. 乙型脑炎病毒 RNA 纯度检查
1) 乙型脑炎病毒 RNA 感染性的鉴定可用小白鼠脑内滴定来完成,也可以在麦胚无细胞蛋白合成系统中测定其 mRNA 活性。
2) 测定分子质量大小,乙型脑炎病毒 RNA 在琼脂糖凝胶电泳中为单一区带。RNA 大小标记物可用正常动物细胞的 18SRNA 和 28SRNA, 在小白鼠细胞中,这两种 rRNA 的分子质量分别是 0.7X106Da 和 1.65Xl06Da
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