基本方案
备选方案
备选方案2
实验材料 | 载体 |
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试剂、试剂盒 | 氨苄青霉素 卡那霉素 pGP 裂解缓冲液 |
仪器、耗材 | 培养箱 分光光度计 离心机 |
实验步骤 |
1. 将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中,转化一种标准大肠杆菌菌株,此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿,于37℃温育培养过夜。
2. 挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中,37℃培养,通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 3. 从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上,30℃下培养过夜(24 h)。挑取单个的转化菌落于LB/卡那霉素培养基中,30℃培养。
6. 按1:40比例稀释1 ml 过夜培养物,30℃下于LB/氨苄青霉素/卡那霉素培养基中长数小时,直至OD394≈0.4。
7. 速将温度升高至42℃,继续培养30 min,诱导T7 RNA聚合酶基因的表达。
8. 将培养温度降至37℃,继续温育90 min 后,离心收集细胞。
9. 通SDS-聚丙烯酰胺电泳分析诱导产生的蛋白。将相当于1.0 ml 培养液中的细胞重悬于0.1 ml 裂解缓沖液中,100℃加热5 min 后,立即将各样本以每份20 μl 的量加到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。可取10 μl 细胞制备适当的细胞提取物检测诱导后的酶活性。
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