还原反应测定
氧化反应测定
| 实验方法原理 |
ADH 反应： 乙醛 + NADPH + H+ ⇌ 乙醇 + NAD+ 此反应是可逆的，并且可以从两个位点检测出来，平衡常数是 8×1012 mol/Ｌ。乙醇的生成是人们希望看到的，由此可以更为简单地检测这个方向的反应进程。但是也有极为不利的因素，即乙醛的毒性以及此反应速度过快。 |
|---|---|
| 实验材料 | 乙醇脱氢酶 |
| 试剂、试剂盒 | 磷酸钾 BSA 溶液 NADH 乙醛 |
| 仪器、耗材 | 分光光度计 |
| 实验步骤 |
实验所需「试剂」具体见「其他」 0.98 ml 的实验混合物
0.02 ml ADH（0.02 IU） 25 ℃ 时，于 340 nm 处吸收值降低。为了方便量化，经常使用 NADH 的吸收系数 ε340＝6.3×103 l/（mol·cm）。
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| 注意事项 | |
| 其他 |
试剂： 0.1 mol/L 磷酸钾，pH 7.5 0.1 g BSA 溶于 100 ml 0.1 mol/L 磷酸钾溶液中，pH 7.5（BSA 溶液） 0.01 mol/L NADH（71 mg 溶于 10 ml H2O） 0.5 mol/L 乙醛，2.2 g（2.82 ml）溶于 100 ml H2O 用 BSA 溶液稀释 ADH：按照其活性，商业购买的酶需要被稀释，例如 0.02 IU 的 ADH 每分钟转化 0.02 mol NADH，相当于吸收值变化 0.126，这是一个对反应来说很方便的数值。对于 400 IU/mg 购买的 ADH，也许需要将 10 mg/ml（4000 IU/ml）的原料溶液溶于 pH 7.5、0.1 mol/L 的磷酸钾中。然后，稀释溶液 4000 倍（2.5 ul 溶于 10 ml BSA 溶液中），使其最终为 1 IU/ml。取出 20 ul 做酶的测定实验。
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