一、检测目的：
1、熟练掌握薄层层析法原理。
2、掌握薄层层析操作作方法。
二、原理
样品中黄曲霉毒素B1经有机溶剂提取，浓缩、净化以及薄层分离前处理后，在波长365nm紫外光下产生兰紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定含量。
三、试剂
1.三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、丙酮
2.正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃).
3.无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水
4.苯――乙腈(98：2)混合溶液：量取98ml苯，加2ml乙腈，混匀。
5.甲醇――水(55：45)溶液：配制方法同上。
6.三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠
7.硅胶G，薄层色谱用。
8.AFTB1标准溶液的制备：用百万分之一的微量分析天平精密称取1～1.2mgAFTB1标准品，先加入2ml乙腈溶解后，再用苯稀释至100ml。然后避光置于4℃冰箱中保存。最后进行AFTB1标准溶液浓度的测定。(此标准溶液浓度为10μg/ml)。
9.AFTB1标准使用液Ⅰ：精密吸取1ml10μg/ml标准溶液于10ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液浓度为1μg/ml。
10.AFTB1标准使用液Ⅱ：精密吸取1.0ml1μg/mlAFTB1标准使用液Ⅰ于5ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为0.2μg/ml。
11.AFTB1标准使用液Ⅲ：精密吸取1.0mlAFTB1标准使用液Ⅱ于5ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为0.04μg/ml。
12.50/L次氯酸钠溶液：取100g漂白精，加入500ml水，搅拌均匀。另将160g工业用碳酸钠(Na2CO3·10H2O)溶于500ml温水中，再将两液混合，搅拌，澄清后，再过滤即可。
四、仪器和用具
1.小型粉碎机、样筛、电动振荡器
2.全玻璃浓缩器、电子恒温水浴锅、薄层板涂布器
3.玻璃板：5cm×20cm。
4.展开槽：内长25cm，宽6cm，高4cm。
5.紫外光灯：100～125W，带有波长365nm滤光片
6.微量进样器、蒸发器：50ml
五、操作步骤
1.样品提取、净化样品去壳去皮粉碎后，称取20g粉碎过筛样品，置于250ml具塞锥形瓶中，加30ml正乙烷或石油醚和100ml甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，等下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶中。取20.0ml甲醇水溶液提取液(相当于4g样品)置于另一个125ml分液漏斗中，加20mlCHCl3，振摇2min，静置分层(如出现乳化则可滴加甲醇使其分层)，放出CHCl3层，经盛有约10g先用CHCl3湿润的无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于50ml蒸发皿中，分液漏斗中再加5mlCHCl3重复振摇提取，CHCl3层一并滤于蒸发皿中，最后用少量CHCl3洗滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风橱内于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰箱内冰却2-3min后，准确加入1ml苯-乙腈混合液(或将CHCl3用浓缩蒸馏器减压吹干蒸干，然后再准确加入1ml苯-乙腈混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，如果有苯的结晶析出，则将蒸发皿取下，继续溶解、混合，晶体则立即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2ml具塞试管中。
2.样品的测定(单向展开法)
(1)薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加入相当于硅胶量2-3倍左右的水，用力研磨1-2min至成糊状后立即倒入涂布器内，推成5×20cm，厚度约0.25mm的簿层板三块。在空气中干燥大约15min后，放入100℃烘箱内活化2h，取出在干燥器中保存。一般可保存2-3d，若放置时间较长，可再进行干燥活化后使用。
(2)点样：将簿层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm处做一个基线，然后在基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约为3mm。要求在同一块板上滴加点的大小应一致，可用吹风机冷风边吹边加。滴加的样点如下：
第一点：10μl、0.04μg/mlAFTB1标准使用液。
第二点：20μl样品溶液。
第三点：20μl样液＋10μl0.04μg/mlAFTB1标准使用液。
第四点：20μl样液＋10μl0.2μg/mlAFTB1标准使用液。
(3)展开与观察：加入10ml无水乙醚于展开槽内，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加入10ml丙酮：三氯甲烷(8：92)溶剂，展开10-12cm，取出在紫外光下观察结果，方法如下：
①第一点滴加10μlAFTB1标准使用液，其中含AFTB10.04μg/ml(最低检出量5μg/kg)。可作为检验薄层板好坏及色谱是否合适，能检出最低检出量。如果展开后此点无荧光，则说明薄层板或色谱条件存在问题。
②第三点和第四点上滴加了样液和AFTB1标准液，可使样液中的AFTB1荧光点和标液AFTB1荧光点重叠。加以认证。
第三点是用来检验最低检出量在样液中是否能正常呈现，如果第一点呈阳性，第三点呈阴性则说明样品的提取存在问题，可能存在荧光猝灭剂，应重新提取。
第四点主要是起定位作用。AFTB1的Rf值约0.6。
③第二点起判断作用。如果第二点(样液)在AFTB1标准点的相应位置(Rf≈0.6)处呈阴性，而其它各点均呈阳性，则说明样品中AFBT1的含量在5μg/kg(最低检出量)以下，如果第二点在其相应位置上呈阳性，则需进行确证试验。
(4)确证试验：为了证明在薄层板上样液呈现的荧光确系由AFTB1产生的，则在样点上滴加三氟乙酸，产生AFTB1的衍生物，继续展开后，此衍生物的Rf值约为0.1左右。方法如下：
依次在薄层板左边滴加两个点：
第一点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。
第二点：20μl样液。
在以上两点处各加一小滴三氟乙酸盖于其上，经反应5min后，用电吹风机吹热风2min，热风吹到薄层板上的温度不得高于40℃，再于薄板右边滴加以下两点。
第三点：10μl0.04μg/mlAFTB1标准使用液。
第四点：20μl样液。
同前展开后，在紫外光下观察样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。第三点和第四点，可作为样液与标准衍生物的空白对照。
(5)稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度与AFTB1标准点(最低检出量)的荧光强度一致，则表示样品AFTB1含量在5μg/kg；如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量或将样液稀释后再点样，直至样液点的荧光强调与最低检出量的荧光强度一致为止，滴加样式如下：第一点：10μg/ml AFTB1标使液。
第二点：根据具体情况点10μl样液。
第三点：根据具体情况点15μl样液。
第四点：根据具体情况点20μl样液。
(6)计算：
X=0.0004×
(3-1)
式中：X——样品中AFTB1的含量，μg/kg；
V1——稀释前样液的体积，ml；
V2 ——出现同样最低荧光强度时滴加样液的点样量，μl；
D——样液的总稀释倍数；
m——稀释前相当样品的质量，g；
0.0004——AFTB1的最低检出量，μg。
注意事项
1.本法的灵敏度较高，容易产生误差。如薄层板制作不平整、不均匀，点样的间距太小等都会产生误差。
2.AFTB1标准储备液应密封于具塞试管中，在4oc冰箱中避光保存。如果在保存期间体积明显减少，应及时补充溶剂。使用前，应对其测定标准液的浓度。
3.AFT是一种剧毒和强致癌性物质，因此，在使用时特别注意其安全保护。如实验时应佩戴口罩，配标液时应戴乳胶手套。如被标液污染时应及时用50g/L次氯酸钠溶液浸泡消毒。实验结束后应做好清洗消毒工作，对于剩余的AFT标液以及呈阳性样液，应先用50g/L次氯酸钠处理后方可倒在指定的地方。实验所用玻璃器皿消毒后再进行清洗(用50g/L次氯酸那浸泡5min)。
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