细胞自噬的研究方法介绍

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：

一、自噬诱导剂

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

(5) Rapamycin：mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

二、自噬抑制剂

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂

(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）

除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义 RNA 干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

三、自噬过程进行观察和检测

细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。

自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

2、在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用 Western Blot 检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成

自噬形成时，胞浆型 LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。
（注意：LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力，会造成假阳性。方法 2 和 3 需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）

4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异

5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

四、自噬相关蛋白的定位

在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker 探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔

（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用 0.1%SDS 处理。）

实验案例 原代XXXX上皮细胞干预培养及MTT细胞增殖毒性检测

实验样本：原代XXXX上皮细胞

实验药物：A药物

刺激浓度：0.1％，0.01％，0.001％，0.000l％

时间点： 30 min、2 h、6 h、24 h

实验方案：常规细胞传代，用第 2～4 代细胞。传代后孵育至少 24 h 至细胞 70％ 融合：细胞移入 96 孔板内，5×103 细胞/孔, 待细胞贴壁后，移去原培养液，加入含 0.1％，0.01％，0.001％ ，0.000l％ 共 4 个浓度的 A 药物培养液。

在 30 min、2 h、6 h、24 h 共 4 个时间点时实验终止，每孔加入 5 mg／mL 的 MTT 溶液 20uL，继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加 DMSO(Dimethyl sulfoxide)150 uL，室温下振荡 10 min，立刻在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值 (选择波长 490 nm)。

每浓度每时间点做 5 孔。设空白对照 1 孔 (不加细胞只加培养液), 最后比色以对照孔调零。实验试剂：MTT（sigma）

操作步骤：在 96 孔板加入细胞 100μL/孔（约 5×103），置 37℃ 5%CO2 细胞培养箱培养 24 小时；

待细胞贴壁后，移去原培养液，加入含 0．1％，0．01％，0．001％ ，0．000 l％ 共 4 个浓度 A 药物培养液；

在 30 min、2 h、6 h、24 h 共 4 个时间点时实验终止；每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液 20ul，继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液；每孔加 DMSO(Dimethyl sulfoxide)150 uL，室温下振荡 10 min，立刻在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值 (选择波长 490 nm)。

实验分组：

A 正常培养组

B 0.0001% A 药物培养液
C 0.001% A 药物培养液
D 0.01% A 药物培养液
E 0.1% A 药物培养液

结果分析：细胞存活率% =（加药细胞 OD -本地 OD /对照细胞 OD-本地 OD）×100％

注：本底 OD 值（完全培养基加 MTT，无细胞）

30 min 时，490 nm 波长各孔的 OD 值

2h时，490 nm波长各孔的OD值

6h时，490 nm波长各孔的OD值

24h时，490 nm波长各孔的OD值