蛋白质磷酸化是一种非常重要且广泛存在于原核生物和真核生物中的翻译后修饰调控方式,参与细胞的增殖、发育、分化、凋亡,细胞骨架调控、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等,对许多生物的细胞功能起着生物“开/关”作用。
蛋白质磷酸化指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制，在细胞信号转导的过程中起重要作用。异常的磷酸化事件常与许多疾病状态相关。
在评估蛋白磷酸化时，可选择的方法有很多，Western blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。磷酸化蛋白的检测具有挑战性，因此在实验的各个阶段都需要特别注意。Vilber为您提供几条小妙招，助力您获得更加满意的实验结果。
1.样品处理：在稳定的环境条件下细胞内蛋白质的生成和分解处于动态平衡，当在体外从细胞和组织中提取蛋白时，细胞内的蛋白酶和磷酸酶就会被释放出来或被激活，导致目的蛋白分解或去修饰，因此需要在提取物中添加适当的蛋白酶、磷酸酶等抑制剂。选用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，并在使用前进行预冷，是防止样品处理时蛋白降解和去修饰的有效方法。
2.选择特异性的磷酸化抗体并检测总蛋白的量：磷酸化抗体主要是针对磷酸化位点制备的是一种位点特异性的抗体。由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，所以需要用非磷酸化的抗体来检测同源蛋白的总水平，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并可充当上样对照。例如：H2O2诱导NIH3T3细胞衰老和AMPK通路抑制。用H2O2处理细胞，在不含H2O2的培养基中培养3-5天，可以通过AMPK的磷酸化水平，检测到AMPK通路的受抑制情况。
Fig. 1 H2O2 induced senescence and AMPK pathway inhibition in NIH3T3 Cells.
Xiaojuan Han et al., Aging Cell (2016) 15, pp416–427
3.封闭：做好封闭可以降低背景，提高检测灵敏度。封闭时建议选择BSA配合TBS缓冲液作为封闭液使用，不建议用脱脂牛奶作为封闭液，因为牛奶中的蛋白质可能会干扰磷酸化蛋白的检测。可室温封闭2小时或者4℃封闭过夜。封闭时膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液。
4.洗膜：洗膜时要选用合适的洗涤液，选用TBST作为洗涤缓冲液，洗膜四次，每次10分钟，在脱色摇床上进行，可以很好的去除膜上非特异性的结合，降低背景。而使用PBS时，缓冲液中的磷酸根，则会产生干扰靶蛋白的磷酸化信号。
Figure1. AtANN4 Regulates the Salt Stress Response in Aradidopsis through the SOS Pathway.
Ma et al., 2019, Developmental Cell 48, 697-709
5.成像：完成了以上所有工作，到了最后检验实验结果的关键步骤--成像。成像时，底物需要现配现用，配制时更要注意避光及两种溶液的充分混合，注意实验的每一个细节才是实验立于不败之地的王道。蛋白的磷酸化水平的变化是一些调控的主要方式，而这些差异变化往往是很细微的，需要精确的检测才能准确的阐述这一调控过程。选择一个灵敏的检测设备，帮您完成最后的检测工作。
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