1、一定要在Lysis Buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂；
2、加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间，因为磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分；
3、选择优质的磷酸化抗体，所以要选好的厂商，Novus为全球高端抗体品牌，其磷酸化抗体效果不错；
4、抗体的稀释倍数要优化，可以根据厂商建议进行优化；
5、用含5% BSA的TBST稀释抗体，不要用常见的5% -Fat Milk的TBST；
6、磷酸化蛋白WB时背景也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则背景太深盖住想要的那条条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅；
7、磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿背景深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。
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