众所周知，CRISPR/Cas9被业内誉为“基因剪刀”，它可以高效地实现靶基因的编辑，自问世以来就备受关注和青睐。CRISPR/Cas9系统是由CRISPR相关基因和Cas9组成，Cas9核酸酶会在向导RNA（Guide RNA, gRNA）的指引下，在完整基因组上的特定位点完成切割反应，同时Cas9的切割也依赖于gRNA和基因组特定位点配对区5′端的PAM结构。
在前几期中我们已经详细介绍过利用CRISPR/Cas9系统构建基因编辑大小鼠的基本流程。然而，在具体的实验过程中，首先大部分的我们都会遇到这样一个问题，该如何根据研究目的设计sgRNA，如何选择活性较高的sgRNA等。
在2013年，哈佛大学David Liu课题组通过研究证明CRISPR/Cas9的特异性仅与gRNA配对的靠近PAM处7-12bp碱基相关,这说明CRISPR/Cas9系统仍存在一定的脱靶风险。因此如何降低CRISPR/Cas9的脱靶效应也成为科研工作者始终关注的焦点问题。由此，设计并筛选高效特异性的gRNA对于降低该系统的脱靶显得至关重要。
今天，小编综合科学家们已发表的研究结果及自己的实验经验，为大家详细介绍一下如何设计和筛选高效的sgRNA。
1、gRNA潜在序列预测
根据实验目的查找目的基因序列，并确定需要编辑的具体区域。将该区域的碱基序列复制至sgRNA预测网站gRNA Designer，从而预测潜在sgRNA序列。接下来根据预测得分值来选择sgRNA靶点(图1)。
gRNA designer网址：http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design-v1
图1. 利用gRNA Designer软件进行靶点预测
2、gRNA特异性比较
选择了得分值较高的一个或数个sgRNA位点后，则需要进一步优化。首先比对初选的候选靶点的核心序列（靠近PAM处7-12bp碱基）在基因组中是否特异，如果在基因组上存在与候选靶点相似度高的序列，则应放弃该候选靶点。
3、gRNA的活性筛选
由于体内的基因组具有复杂的结构，仅凭软件预测和理论推导仍无法确定所选择的gRNA是否有效，以及活性是否较高，因此我们需要进行gRNA活性筛选。
首先我们将所选gRNA对应的基因组靶点上下游各400bp（共800bp）的片段克隆至pUCA(Luc)质粒中，以造成荧光素酶（luciferase）蛋白翻译提前终止，从而表达无功能的荧光素酶。
同时将gRNA构建至px459质粒中，与pUCA共同转染293T细胞，Cas9蛋白能对靶位点的切割形成完整的荧光素酶编码序列，从而表达有功能的荧光素酶。因为荧光素酶的活性与CRISPR/Cas9 的活性成正相关，所以可利用Luciferase report试剂盒，通过检测荧光素酶表达量来指示gRNA的活性（图2）。
图2. gRNA活性检测流程图
筛选出了活性高的gRNA后，似乎下一步加上Cas9蛋白酶就构成了CRISPR/Cas9系统了，可以用来构建基因编辑动物了。但其实还远远不够，其中还有很多十分重要的环节，你也必须掌握，且听下次分解。
参考文献：
Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819-23.
Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP et al.High-throughputprofiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 2013;31(9):839-43.
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