融合蛋白 Enbrel (Etanercept) 是由人的肿瘤坏死因子（TNF，Tumornecrosis factor）膜外受体部分和人的免疫球蛋白（IgG1）的 Fc 部分融合而成，是一种人源 TNF-α 受体抗体融合蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF-α）的拮抗剂，它通过抑制 TNF-α 可以起到控制炎症、阻断病情进展的作用，它属 DMARD 类药物，可用于活动性类风湿关节炎、牛皮癣及关节性牛皮癣、幼年特发性关节炎、及活动性强直性脊柱炎。
二硫键作为共价键交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，对于稳定蛋白质的空间结构、维持正确的空间折叠构象、保持及调节其生物活性等都起着举足轻重的作用，尤其对于生物药品，二硫键的位置和连接情况对于生物药物的空间结构、药物活性等起着关键的作用。目前，常用的定位二硫键的方法主要分为X射线衍射晶体结构解析法、多维核磁共振法、二硫键异构及突变分析法、酶解法和化学裂解法等，这些方法都各具特色，也各有局限性。随着质谱仪器在质量检测范围、分辨率、灵敏度、准确度和分析速度等方面的不断发展，从而使得质谱分析法更加适用于二硫键的定位分析中。目前，常用的质谱碎裂技术，包括碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）和电子转移解离（ETD）等都可以直接应用到二硫键的碎裂分析中，不过不同的碎裂模式对于化学键的断裂各有特点：ETD 更加易于肽段间的二硫键断裂，而 CID 更加易于肽段中肽键的断裂，因此将二者联用起来，也就是 ETD-triggered CID 的方法，可以首先通过 ETD 打开肽段间的二硫键，得到二硫键的连接信息，然后采用 CID 将解离开的肽段分别进行碎裂，从而得到肽段的氨基酸序列，这样就可以在一次实验中，得到完整的二硫键的定位信息，如图 1 所示。
目前，最新的 Orbitrap Fusion 和 LTQ-Orbitrap 系列的组合式质谱仪都结合了最新的双压线性离子阱质谱仪和新型高场 OrbitrapTM 质量分析器，可以提供超高的分辨率、超高的灵敏度、快速的扫描速度和更大的动态范围，并且可以在同一台质谱上同时实现低分辨和高分辨扫描，从而都可以进行以上的二硫键定位分析，为各种蛋白质样品，特别是各种生物药产品，比如单抗、融合蛋白等提供了准确、快速、可靠的分析测试方法与平台。
图 1. 应用于二硫键定位分析的 ETD-triggered CID 实验示意图（HR 表示高分辨扫描，LR 表示低分辨扫描）
2. 实验部分
2.1 仪器和试剂
质谱仪器：Orbitrap Fusion（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱仪器：Easy Nano1000液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱柱：自制反相色谱柱（C18，2 μm，75×150 μm，100 Å）；
试剂：色谱级甲酸、二次去离子水，色谱级乙腈。
2.2 仪器方法
色谱分析条件：具体见表 1；
质谱分析条件：具体见表 2；
表 1. 融合蛋白二硫键分析的色谱条件
表 2. 融合蛋白二硫键分析的质谱条件
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