简介
在 1938 年，美国政府通过了联邦食品、药物和化妆品法令（ FFDCA ， FDCA ，或 FDA ），赋予美国食品和药品监督管理局（ FDA ）督察食品、药品和化妆品的权利。如今，美国 FDA 管理着除了美国农业部管理的肉类、家禽肉和某些奶制品之外的国内和进口的所有食品。现在，所有的牛奶都要由 FDA 、美国政府和牛奶生产商共同努力监控药物残留。在 2007 年的财政年报 1 中，有超过 400 万的样品都要分析广大范围的抗生素，如内酰胺、大环内酯和四环素。例如，美国 FDA 建议牛奶中某种大环内酯类抗生素替米考星的最大残留量（ MRL ） 50ug/kg ，这个标准也被欧盟接受。许多国家都遵从美国食品和农业联合组织 / 世界卫生组织（ WHO ）的 40 μ g/kg 的最大残留量，而不是为每种药物设置各自的最大残留量。
大环内酯类是一组药物，它的活性来源于大环内酯环的存在，而大环内酯环上有可能有一个或多个脱氧糖，经常为二脱氧甲基已糖和脱氧糖胺。内酯经常是 14- 、 15- 或 16- 环的。大环内酯类抗生素被广泛应用于兽医药物，以治疗许多疾病，例如哺乳期奶牛的呼吸道疾病、临床症状不显的乳腺炎，或者它们可以被作为饲料添加剂以促进生长。如果牛奶提取期太短，抗生素残留可能仍然存在，可对消费者带来直接的毒副作用（过敏反应） 2 。
图 1 大环内酯类抗生素
离线的 SPE 萃取方案
传统上，微生物检测 3 被用来监测食品基质中的抗生素。这些方案都有很好的定量结果，但越来越缺乏高度的专属性。随着现代实验室 LC/MS 或 LC/MS/MS 系统的普遍使用，多残留方法是更被常规工作所认可的方法。
包含食品基质的分析方案通常是很复杂的，需要数个小时的手动操作。例如，饮用水方案（较低的样品复杂度）由下列步骤组成：直接上样到 SPE 小柱、少量的清洗步骤、洗脱，以及最后的蒸干和用流动相复溶。象食品样品之类的固体基质（较高的样品复杂度）必须先用水溶液或有机提取缓冲液均质提取，然后是一些离心步骤、液液萃取（可选项），最后在实施 SPE 萃取方案前用水溶液稀释。关于牛奶分析，最常用的萃取方案是用乙腈沉淀蛋白 4 。混合物然后离心数分钟。上清液可以用其它的萃取技术进一步提纯。
离线的 SPE 牛奶方案
步骤 1 ： 加入 5mL 的牛奶到 50-mL 的离心管中
步骤 2 ： 加入 15mL 的乙腈
步骤 3 ： 涡旋并在 3200RPM 转速下离心 15min
步骤 4 ： 转移上清液到 50-mL 的离心管中
步骤 5 ： 加入 20mL 的正己烷
步骤 6 ： 涡旋 15min
步骤 7 ： 在 3200RPM 转速下离心 15min
步骤 8 ： 移去正己烷层
步骤 9 ： 蒸发乙腈 / 牛奶上清液到 3mL
步骤 10 ： 加入 15mL 0.1M 、 PH 为 8.0 的硫酸盐缓冲液
步骤 11 ： 用 10mL 的甲醇活化 Oasis® HLB （ 6cc ）
步骤 12 ： 用 10mL 的水活化 Oasis® HLB （ 6cc ）
步骤 13 ： 用 10mL2% 的 NaCl 活化 Oasis® HLB （ 6cc ）
步骤 14 ： 用 2mL 0.1M 、 PH 值为 8.0 的磷酸盐活化 Oasis®HLB （ 6cc ）
步骤 15 ： 上载复溶的样品（步骤 10 ）
步骤 16 ： 用 5mL 的水清洗
步骤 17 ： 用 5mL40% 的甲醇水溶液清洗
步骤 18 ： 使 Oasis HLB 流干 5min
步骤 19 ： 用 5mL95% 的甲醇水溶液洗脱
步骤 20 ： 蒸发近干（ 45min ）
步骤 21 ： 用 1mL 的初始条件流动相复溶
步骤 22 ： 用 0.45 μ m 的聚偏二乙烯氟化物（ PVDF ）过滤萃取物
在线的 SPE 萃取方案
以前的出版物（在线 SPE/LC/MS/MS 部分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）介绍了新颖的自动化萃取 / 分析技术： Waters AquaAnalysis 系统。总体解决平台带来了多种好处：减少手工操作、减少溶剂消耗和减少样品体积。使用在线的 SPE/LC/MS/MS 技术平台省去了消耗时间的蒸干 / 复溶步骤。
在线的 SPE/LC/MS/MS 技术不仅仅适合于饮用水分析。饮用水样品可直接上样到自动进样器，然后就是完全自动化的电脑控制的萃取 / 分析步骤。对于食品分析，固体样品要先转变成液体形式。分析开始于均质化以释放被束缚的分析物到液相萃取缓冲液。均质化需要经过离心步骤，然后上清液被转移出来。在这时，目标分析物以合适的形式存在，以便于其它的净化、浓缩或萃取步骤，例如，液液提取（ LLE ）和 SPE 。通过使用软件控制下的在线 SPE 方案，食品样品的萃取 / 分析过程现在仅需要均质化、离心和稀释步骤。
在线的 SPE 牛奶方案
步骤 1 ： 加入 1mL 牛奶到 50mL 的离心管中
步骤 2 ： 加入 20ul 一定浓度的氨水
步骤 3 ： 加入 2ml 的乙腈（ 2:1 的比例）
步骤 4 ： 涡旋并在 3500RPM 的转速下离心 15min
步骤 5 ： 转移 2mL 的上清液到 20ml 的进样瓶
步骤 6 ： 加入 18mL 的水
步骤 7 ： 进样 5mL
实验
大环内酯所用的 MRM 条件都列在了表 1 中。使用的 SPE 萃取柱是 Waters® Oasia HLB 2.1x 20 mm ， 25 μ m ，中性 pH 值上样，流动相（无添加物 ) ）。使用的分析柱是 XBridgeTMC18 2.1x 50 mm 3.5 μ m ，低 pH 值流动相洗脱。清洗和再活化参数都列在了下面。
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