用于生产MSCs的大鼠骨髓原代培养

试剂和材料：
1. 完全培养基（CCM）：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。含0.2μg/ml两性霉素B。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
2. PBSA；
3. 塑料组织培养Petri培养皿，15cm直径；
4. 聚丙烯离心管，15ml和50ml；
5. 0.85%台盼蓝盐溶液；
6. 改良的Neubauer血细胞计数器；
7. Eppendorf 5417C微量离心器或同等设备；

实验方法：
1. 从一根股骨所得的骨髓悬液中取出10μl，与10μl台盼蓝混合，评估存活率，确保高于80%；
2. 1000g离心10min沉淀骨髓；
3. 用25ml预热的含抗真菌药物的CCM重悬骨髓（处理大鼠骨髓细胞使用抗真菌药物，人骨髓细胞不使用）；
4. 将25ml细胞悬液加入到15ml直径的组织培养板中，37℃，5%CO_²环境下至少孵育15h；
5. 从培养箱中取出培养板，吸出培养基；
6. 用20ml预热的PBSA润洗单层细胞。重复润洗过程3次，将最后的洗涤产物加入30ml预热的含抗菌药物的新鲜CCM中（只有大鼠细胞使用抗真菌药物）；
7. 如有需要每隔两天重复步骤6，维持6—14天；
8. 每3天用倒置显微镜观察单层细胞。贴壁、成纤维细胞样的MSCs集落可以在培养板中清洗可见。某些情况下，这可能是造成细胞污染的信号，但这些细胞随着细胞传代过程可被去除。当培养物达到40%—50%汇合时，按照MSCs自我更新的集落形成单位测定的方法处理细胞。这些MSCs标记为0代；