收集大鼠骨髓用于MSCs生产
大鼠骨髓原代培养用于MSCs生产
实验方法原理 | |
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实验材料 | 大鼠骨髓 |
试剂、试剂盒 | 灭菌CCM含0.2μg ml两性霉素B(两性霉素B洗剂) 纱布 含100U ml青霉素 100μg ml链霉素和0.2μg ml两性霉素B的PBSA 无镁和钙的Hank’s平衡盐溶液(HBSS) |
仪器、耗材 | 塑料Petri培养皿 15 cm直径 装有#10和#15刀片的解剖刀 1和2英尺刀刃的手术剪 镊子 止血钳 15 cm刀刃的咬骨钳 带Luer接头的注射器 20ml皮下注射针 23号和18号 微量离心管 1.5ml和0.5ml聚丙烯离心管 CO2啮齿动物安乐死小室 |
实验步骤 | (a)CO2窒息处死动物,切勿使用药物。 (b)用酒精擦拭后肢,在不破坏股骨的情况下解剖后肢。将股骨从肢体中分出来。 (C)切除股骨上的肌肉和肌腱。用无菌纱布擦拭除去骨上的剩余组织。 (d)用酒精擦拭已清理干净的骨,将其放人50 ml塑料管中。 (e)用含抗真菌药物的冰浴CCM浸没骨,直到骨髓提取准备完毕。从分离骨到骨髓提取的时间应尽量缩短。 (f)装有股骨的离心管移至微生物安全厨中,将骨放人15 cm petri培养皿中。 (g)按如下步骤提取骨髓:用咬骨钳剪掉骨的两端,暴露内部骨髓。装有23G针头的注射器中吸人5ml含抗真菌药物的CCM,向50ml离心管中冲洗每根股骨。吸取冲洗后的CCM,反复冲洗股骨3次,将其转移至15 ml离心管中。1000g离心,用1ml含抗真菌药物的CCM重悬骨髓沉淀。在15 ml离心管中将1 ml骨髓细胞悬液加入到4 ml含抗生素和抗真菌药物的新鲜PBSA中。每根股骨所得的5ml细胞悬液可混合于同一个离心管中。 (h)在l0℃1000g离心骨髓细胞10 min,用10ml含抗生素和抗真菌药物的PBSA洗涤细胞3次。 (i)最后,用5 mlCCM重悬骨髓细胞,置于冰上。 展开 |