第 3 阶段：克隆的扩增与 PCR 产物的评估
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
DEPC 处理过的 H20
TAE 缓冲液，1×（40 mmol/L Tris-乙酸盐，1 mmol/L EDTA，pH 约 8.5)
DNA 点样缓冲液（200 g/LFicoll400，0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0,10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚蓝，2.5 g/L 二甲苯腈)
dATP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dGTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dTTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
dCTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)
2. 酶和酶缓冲液
AmpliTaq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer)
GeneAmp PCR 缓冲液，10X(Applied Biosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
载体或基因特异性引物（1mmol/L)
100bp DNA ladder(New England Biolabs)
4. 凝胶
球脂糖凝胶（20 g/L,TAE 缓冲液)
5. 专用设备
薄壁 PCR 板和 Cycleseal PCR 板封板器（Robbins Scientific)
可容纳 4 个 50 孔梳子的电泳装置
热循环仪
6. 附加器材
琼脂糖凝胶电泳所需的设备和试剂，包括溴化乙锭
1. 为每个要扩增的 96 孔板配制含有以下成分的主体 PCR 混合液。
PCR 缓冲液，10X(含有 15 mmol/LMgCl2)1000ul
dATP(100mmol/L)20ul
dGTP(100mmol/L)20ul
dCTP(100mmol/L)20ul
dTTP(100mmol/L)20ul
引物 1(lmmol/L)5ul
引物 2(lmmol/L)5ul
AmpliTaq 聚合酶（5U/ul)100ul
DEPC 处理过的 H20 8800ul
2. 标记好 96 孔 PCR 板，在每个孔中分装 100ulPCR 混合液。
轻扣 PCR 板，确保没有气泡残留在孔的底部。
3. 在每个孔中加入 1ul 纯化过的质粒模板，并盖好盖子。
4. 进行下面的循环反应。
在进行质量对照的凝胶分析时，将板子保存在 41°C。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳，检测 PCR 产物。
凝胶成像只能对产物进行粗略的定量，但可以提供很好的产物组成的特征。
6. 从每个孔中取 2ul, 与 2ul 点样缓冲液混合。
7. 以 100bp DNA ladder 作为标准，在 2% 琼脂糖凝胶上分析样品。
每个泳道应该显示一条单一的主带，各泳道之间产物的亮度应该相同。
第 4 阶段：PCR 产物的纯化与定置
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
乙醇/乙酸盐混合液 (95% 乙醇，5%3mol/L 乙酸钠，PH6.0)
乙醇，70%
SSC 缓冲液，20X(3mol/LNaCl，0.1mol/L 柠檬酸钠·2 H20，用 1mol/LHCl，调 pH 至 7.0)
TAE 缓冲液，1X(40 mmol/LTris-乙酸盐，1mmol/LEDTA，pH 约 8.5)
DNA 点样缓冲液（20%Ficoll400,0.1mol/LNa2EDTA,pH8.0，10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚蓝，2.5 g/L 二甲苯腈)
2. 离心机和转头
具有水平（吊桶式）转头的离心机，深 6.2 cm, 可以离心微量滴定板和过滤板（例如，SorvallSuperT21，Sorvall)
3. 核酸和寡核苷酸
100bpDNAladder(New England Biolabs)
双链 DNA 标准样，变化范围是 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml
参考双链 DNA(0.5ug/ml)(Invitrogen)
4. 凝胶
琼脂糖凝胶（20 g/L,TAE 缓冲液）
5. 专用设备
V 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)
Immunowash 微量滴定板清洗仪（BioRad)
纸巾
可热封的储存袋和热封器
65°C 培养箱
可容纳 4 个 50 孔梳子的电泳装置
电泳电源
用于荧光检測的 96 孔板（Dynex)
荧光计（例如，Perkin-Elmer Analytical Instruments)
6. 附加器材
FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes)
二、方法
1. 在 V 形底 96 孔板的每个孔中，加入 200ul 乙醇/乙酸盐混合液。
2. 将每个孔中的 100ulPCR 产物，转到 V 形底的板子中，并用 75ul 移液管吹吸 4 次混匀。
3. 将板子放在-80°C 冰箱 1h, 或者在-20°C 保存过夜。
4. 将板子解冻以降低其脆性，并溶解孔中可能形成的冰。
5. 将板子放入带有微量滴定板转头的离心机中，以 2600 g、4°C 离心 40 min。
6. 用 Immunowash 微量滴定板清洗仪吸去每个孔中的上清液。
建议在每个孔的底部留约 10~20ul, 以避免将沉淀搅起。
7. 用 Immunowash 微量滴定板清洗仪在每个孔中加入 200ul70% 乙醇。
8. 以 2600 g 4°C 离心 40 min。
9. 用 Immunowash 微量滴定板清洗仪将每个孔中的上清液吸去。
10. 用纸巾将板覆盖，在一个封闭抽屉中干燥过夜。
1.PCR 产物的重悬浮
11. 在每个孔中，加入 40ul3XSSC。用薄片密封器或合适的封条将板子封好，注意要将每个孔都封严。
重新悬浮 PCR 产物的缓冲液，是由制作微阵列的点样仪和芯片决定的。
12. 将板子放在热封的袋子中，里面放有 3 X SSC 浸湿的纸巾。
13. 将袋子在 65°C 培养箱中放置 2 h, 关掉培养箱使板子逐渐冷却。
在培养箱中冷却板子，可以避免封条上产生冷凝水。
14. 取 1ul 重新悬浮的 PCR 产物，在 2% 琼脂糖凝胶上分析，如第 3 阶段中所述。
充分的沉淀和重悬浮，将产生非常亮的条带。
15. 装有重悬浮 PCR 产物的板子，在- 20°C 保存备用。
2. 用荧光测定法对 PCR 产物定量
16. 在荧光测定专用 96 孔板的每个孔中，加入 200ul 荧光剂缓冲液（FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit)。
17. 在荧光测定板的每个孔中，加入 1ulPCR 产物。
18. 在荧光测定板的最后一排，各加 1ul 双链 DNA 标准样，分别为 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml dsDNA。
19. 设定荧光计激发光为 346nm, 发射光为 460nm。
20. 在 0~500ug/ml dsDNA 的范围内，测试标准样是否悬线性的，以及是否可重复。
21. 从所有对照和其他样品测得的数值中，减去 0ug/ml 样品的数值后，按照下面的方程
计算 PCR 产物中 dsDNA 的浓度。
22. 根据上面的计算，对于超出预计印刷浓度范围（0.1~0.5ug/ul) 的 PCR 产物，要调整浓度。
第 5 阶段：印制微阵列
完成了前面的方案，研究者将会得到制作微阵列所必需的点样材料。印制微阵列的方案参数是由所使用的点样仪和芯片决定的。由于有几种点样仪和芯片的组合可以用来制作微阵列，这里不再给出 PCR 产物点样的详细方案，可以在其他地方找到（Bowtell and Sambrook 2003)。
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