试剂、试剂盒 缓冲液、溶液和试剂生物分子 酶和酶缓冲液核酸和寡核苷酸凝胶
仪器、耗材 专用设备
实验步骤
第 1 阶段：影印铺板与工作库的制备
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
羧苄西林（100ug/ml 储存溶液）
乙醇（100%)
甘油，45%(体积分数）
LB 液体培养基。（1L LB 液体培养基含有 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、5 gNaCl)
超级液体培养基。(1L 超级液体培养基含有 32 g 胰蛋白胨、20 g 酵母提取物、5 gNaCl、5 ml 1mol/LNaOH）
2. 生物分子
核对过序列的母系克隆或 EST(例如，gf211release，ResearchGenetics)
3. 其他仪器
具有水平（吊桶式）转头的离心机，深度 6.2 cm, 可以离心微量滴定板和过滤板（例如，Sorvall SuperT 21，Sorvall)
Airpore Tape Sheets(Qiagen)
Bunsen 喷灯
培养箱，预设为 37°C
96 针接种器（V&P Scientific)
深 96 孔微量滴定板，1.0 ml,PP(V WR International)
U 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)
纸巾
带有深孔板固定装置的振荡培养箱，37°C
带拉链的袋子（zip-lock bag)，1 加仑（约 4L)
二、方法
1.将密封的母系克隆板在 37°C 下培养过夜。
2.准备制备克隆系的工作复本：标记 96 孔圆底（U 形底）的微量滴定板，在每一个孔中分装 100ulLB 液体培养基，含有100ug/ml 羧苄西林。
用这些工作复本来保持母系克隆。检验确保这些克隆都具有载体赋予的氨苄西林抗性。
3.在水平式微量滴定板转头中离心母系克隆板，1000r/min 离心 2 min，除去板子封条上的冷凝水。
4.在一个小烧杯中装一些 100% 乙醇，将 96 针复制工具在乙醇中浸泡。然后从乙醇中取出工具，并烧接种针。
5.短暂冷却后，将复制工具在母系克隆板中蘸一下，然后转到工作克隆板上。如果必要，每个板子都重复接种一次。
6.将接种后的 LB 板子盖上盖子，放到装有湿纸巾的 1 加仑（3.78541dm3) 带拉链的袋子中，将袋子密封后，在 37C 培养过夜。
7.在深孔板的每个孔中，分装 1ml 含有 100ug/ml 羧苄西林的超级液体培养基。
这些板子将作为制备模板的培养液的来源。
8.1 天后，用复制工具直接从新鲜的 LB 板中接种至深孔板。
9.用 Qiagen Airpore Tape Sheets 将深孔板密封，并在上面盖上塑料盖，在 37°C 振荡培养箱中以 200r/min 培养 24 h。
10.对于要被冷冻（-80°C) 作为以后培养源的板子，在每个孔中加入 5ul 45%(体积分数）的无菌甘油。从剩下的板子中分离质粒模板。
第 2 阶段：质粒模板的分离
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
乙醇，70%
T low E 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl，O.lmmol/LEDTA,pH8.0)
2. 离心机和转头
具有水平（吊桶式）转头的离心机，深 6.2 cm, 可以离心微量滴定板和过滤板（例如，Sorvall SuperT 21,Sorvall)
3. 专用设备
封板器
涡旋混匀器
4. 载体和细菌菌株
从上面第 1 阶段第 9 步获得的细菌培养液
&附加试剂
AlkalineLysisMiniprepkit,96 孔 (EdgeBiosystems)
二、方法
1. 将裂解缓冲液（Edge Biosystems Kit) 加热到 37°C, 使 SDS 溶解。
2. 加入 lml 的 RNA 酶溶液至 100 ml 重悬浮缓冲液（Edge Biosystems Kit) 中。在 4°C可保存 3 个月。
3. 在 EdgeBiosystemsKit 接收板的每个孔中，加入 350ul 细菌培养液。将过滤板放在其顶部，并用带子固定。
4. 用装有 96 孔板转头的离心机，将深孔板中的细菌培养液以 1500 g 离心 7 min。
5. 迅速地在干净的纸巾上将板子颠倒，并轻扣出剩余的培养基。
这一步不要耽搁，否则沉淀会松动，在倒出培养基时可能损失。
6. 每个沉淀各加 100ul 悬浮缓冲液重新悬浮，涡旋混匀，直到所有的沉淀都悬浮起来。
悬浮不充分会造成细胞呈块状，在随后的步骤中不会裂解。
7. 在每个孔中加 100ul 裂解缓冲液，轻轻摇动板子混合 lmin, 避免使细菌染色体 DNA断裂。
8. 在每个孔中加 100ul 沉淀缓冲液，混合 1 min。
9. 在每个孔中加 100ul 中和缓冲液，并涡旋混匀 20s。
10. 将深孔板中的混合物转到预先装配好的过滤/接收组装板中。
11. 在装有 96 孔板转头的离心机中，将叠起来的板子以 1500 g 离心 12 min。
12. 取下并弃去过滤板，从接收板中倒出乙醇和滤出液，在干净的纸巾上吸干剩余的乙醇。
13. 在每个孔中加入 500ul 70% 乙醇，立即倒出，并在干净的纸巾上吸干剩余的乙醇。
14. 除去盖子，将板子放在干净的抽屉中，并用干净的纸巾覆盖，干燥过夜。
15. 各加 200ul T low E 缓冲液，悬浮每个 DNA 沉淀，用封板机将板子顶部密封，使沉淀在 4°C 再水化至少 2 天。若长期保存，应放在-20°C。
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