10 mL 裂解试剂溶液的配方：10 mLB-Per 或 BugBuster,20/iLLysonaseBioprocessingReagent。如果需要减少蛋白质水解和增加目标蛋白质可溶性及稳定性可以添加，如 EDTA、蛋白酶抑制剂、5%~10% 甘油和还原剂等添加剂。选择缓冲液的成分及其浓度时要考虑到随后的纯化和检测的需要。
(1) 将 ImL 培养基加入 2 mLX96 孔板中, 或者将 5 mL 培养基加入 24 深孔的平板中，并用透气的封口膜或 BugStopperTM 封口帽 (capmat) 封口以培养菌体和表达目标蛋白质。
(2) 离心收集菌体。
(3) 吸出并弃去培养基。
(4) 用移液器重悬菌体于 100~200yL 裂解缓冲液中。
(5) 混合并在摇床上振荡 10 min 以进行反应。
(6) 吸取 10 混合液以进行全菌体裂解物分析。
(7) 离心 5 min 后取出 10 上清液以分析可溶性蛋白质。剩余的上清液则可用于其他分离或分析操作。
(8) 出现在不溶组分中的目标蛋白质的量可以通过比较第（6) 步的全部菌体提取物和第 (7) 步中的可溶性蛋白质之间的差别来间接估计。典型的样品比较方法是电泳、酶联免疫吸附实验 (ELISA) 或酶学分析。不溶组分的直接检测可通过吸出可溶性的上清液后，将剩余的沉淀部分溶于 SD^PAGE 上样缓冲液中之后进行电泳的方式得出。
注意: 制备 SDS^PAGE 的蛋白质样品的程序和技巧在 Grabski 和 Burgess(2001) 中可以得到。这篇文章提供了 SD&PAGE 样品缓冲液的配方、蛋白质样品制备、凝胶上样建议，并且给出了分析难以分析的样品的替代方法。
10 mL 裂解试剂的配方：10 mLPopCulture、FastBreak 或 B-PerDirect,200yLLysonaseBioprocessingReagent。随后的规程能够在多孔板利用自动液压传动平台来完成，在一块平板上可以采用多通道移液器来对多种培养物同时进行操作。用于将亲和树脂从培养物提取物和经过处理的溶液中分离的多孔过滤板能够从多个制造商获得。利用专门的磁性针板 (magneticpinplate) 或者平台来分离磁珠已获得成功。
(1) 在 2 mLX96 孔的板中加入 ImL 或者在 10 mLX24 深孔的平板内加入 5 mL 培养基培养细胞并表达目标蛋白质，并用透气的封口膜或者 BugStopperTM 封口帽封口。
(2) 添加 1/10 培养基体积的裂解试剂。
(3) 用移液器混合，并在摇床上振荡 10miri 以使反应充分进行。
(4) 取出 50yL 全细胞裂解液混合物以用于分析。样品可采用电泳、ELISA 或酶法分析。直接的 SD^PAGE 分析和考马斯亮蓝染色分析需要髙表达水平和很大的样品上样量或通过沉淀的方法来检测被稀释的蛋白质样品。用特别的滤板 (Pall,Millipore,3M) 能够从蛋白质溶液中去除蛋白质聚集体和包涵体，从而在这一步能够很容易的检测蛋白质的可溶性表达水平。
(5) 直接将平衡好的亲和捕获树脂 (affinitycaptureresin) 或亲和磁珠加入到未经处理的细胞裂解物中。典型的加量为 50~100 ML 凝胶浆 (在捕获缓冲液中含有 50% 的凝胶浆 VmL 起始培养基体积，根据凝胶对重组蛋白的捕获能力和目标蛋白质的表达水平来决定具体添加量。
(6) 用 10~30 倍凝胶体积的漂洗缓冲液来清除杂质。
(7) 用 3 倍体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质。
10 mL 裂解试剂的配方:10niL 浓度为 50~100_ol/L 的裂解缓冲液 (采用甘氨酸、乙酸钠、Tris-HCK 磷酸钠或 HEPES 中的某一种取决于所期望使用的 PH)，50~
300mrnol/LNaCl，30jixLLysonaseBioprocessingReagent。例如，EDTA、去垢剂、蛋白酶抑制剂、5%~10% 甘油和还原剂等可以按需要添加到裂解缓冲液中用于减少目标蛋白质的水解, 增加其溶解性和稳定性。当选择裂解缓冲液成分及其浓度时要考虑到下游的纯化及分析过程的要求。
冻融法裂解细胞的效率取决于细胞悬液的密度、冻融的循环数、冰冻的速率。但是实验表明，其对于大肠杆菌中的蛋白质释放的效率低于球珠涡旋法 (beadvortexing)、弗氏压碎器或超声 (BenovandAl-Ibraheem，2002)。然而，当结合溶菌酶裂解时，对于不稳定蛋白质来说其是一种温和的释放方法，并且不需要特殊的装置。缓慢的冻融循环破裂细胞膜，将细胞壁暴露使之与酶接触并被降解。
(1) 将 ImL 培养基放在 2 mLX96 孔板中，或者将 5 mL 培养基放在 10 mLX24 深孔的平板中，并用透气的封口膜或 BugStcwerTM 封口帽封口以培养细胞并表达目标蛋白质。
(2) 离心使菌体形成沉淀。
(3) 吸出并弃去残余培养基。
(4) 将菌体置于_20°C 至完全冰冻。
(5) 用移液器加人 100~200 裂解试剂并重悬菌体。
(6) 将之置于摇床上室温振荡反应 10 min。
(7) 再次将悬液重新置于一 20°C 至完全冻结。
(8) 室温溶解, 混匀，并取出 10fxL 全细胞裂解混合物以备分析。
(9) 离心 5 min, 取出 10juL 上清液以分析可溶性蛋白质，剩余的已经澄清的上清液则可用于其他纯化或检测过程。『’
(10) 不溶组分中目标蛋白质的量可以通过比较第（8) 步获得的全细胞裂解液和第 (9) 步获得的可溶性蛋白质样品之间的差别间接分析得出。典型的比较分析方法是电泳、ELISA 或酶法。不溶组分的直接分析可以通过吸出上清液后，将沉淀部分溶于 SDSPAGE 上样缓冲液中，并 SD^PAGE 分析得出。
以下所述超声流程适用于 2~50 g 菌体的裂解。
(1) 用已称重去皮的离心桶或离心管 9000 g 离心 15 min 以收集菌体。
(2) 倾出并弃去培养基，将离心桶倒置在纸巾上以去除残余的培养基，记录菌体湿重。
(3) 将菌体置于一 20°C 完全冻结, 并于一周内处理以获得最佳的结果。长期储存菌体应置于一 80°C 以使蛋白酶水解最小化。新鲜的未冻结的菌体也可以使用，但是由于细胞膜还很完整，使得用溶菌酶对菌体进行预处理的效率很低。
(4) 用手持勻浆机在低转速情况下将菌体按照 7~10 mL/g 的比例完全重悬于 4°C 的裂解缓冲液中，避免剧烈的搅拌产生气泡以防止氧化作用。
(5) 可选择的：加鸡蛋中提取的溶菌酶 (0.2 mg/mL) 或重组的溶菌酶（60KU 或 0.2pL/mL) 并添加核酸酶，如 DNaseClOpg/mL) 或 Benzonase(l.0pL/mL)。
(6) 将悬浮液置于玻璃烧杯内，并置于冰上超声 60~90s。通过调整机器设定、探针插入深度和超声持续时间防止过热和打空。注意: 操作时不能使超声探头接触到玻璃烧杯，以防止玻璃破裂。对于 100 mL 菌体悬液来说，用 BransonModelS-450sonifier(BransonSonicPowerCo.，Danbury，CT;www.bransonultrasonics.com) 采用 1/2 英寸直径的探头, 设定 4 组超声，每组 8 次，占空比为 70%，通常就能达到裂解效果。每次超声间隔几分钟, 并置于冰上搅拌。如果需要，在此处取出 5(VL 样品 (在离心之前) 用于分析全菌体的蛋白质。
(7)4°C、15000 g■离心 15 min, 将上清液转移到另一个容器中，小心操作，不要搅动菌体沉淀。依照下一个分离步骤对颗粒的耐受情况，可溶的组分可以通过低蛋白质吸附的滤器过滤进一步澄清。如果采用注射器式滤器 (syringefilter) 进行澄清，可以以串联的方式在上面放置 0.8yin 滤膜，下面放置 0.45 滤膜。大孔径的滤器在流路中首先防止小孔径尺寸滤器处的污垢沉积过快。最终澄清的上清液含有菌体蛋白质的可溶的组分，并且可以直接进行色谱层析或其他下游的分离或分析操作。
下面所介绍的批量化的高压匀浆操作适用于采用 APVGaulin 匀浆机（APVFluidHandling,Delevan,WI;www.apv.com)、Microfluidizer 或 ConstantSystem 的液压破碎仪处理湿重为 50~500 g 菌体的操作。高于 500 g 菌体的裂解应该采用多批次的处理方法，或采用之前所提到的连续的菌体裂解设备。
(1) 接着上面所说的超声处理方法的第 (3) 步和第⑷步的方式重悬新鲜或冰冻的菌体，如果采用瓦林式（Waring) 或小型混合器（WaringProducts，Torrington,CT;WWW.waringproducts.com)，则注意需要低速重悬菌体，不要过度搅拌并且在全程保持提取物处于冷却状态。算上裂解之后漂洗裂解设备的缓冲液，重悬的体积应该少于 10 mL/g 的比例。混合之前，从已经计算好的重悬体积中取出 50~100 mL 的裂解缓冲液放在一边备用。这些缓冲液将用来在样品处理之后冲洗设备。用这些缓冲液冲洗可以将设备死体积中的残余提取物冲出。
(2) 如果采用 Gaulin 细胞裂解器，在裂解大肠杆菌时，在 10000psi 压力下处理两次。当处理难以裂解的菌体，如酵母菌，可能需要更多的处理次数或持续循环处理。如果采用的是 Microfluidizer 或液压式的细胞匀浆机，则按照厂商的操作说明进行操作。在处理过程中，特别是小体积的操作时, 样品会发生非常明显的产热现象。在处理过程中，通过将收集管路浸入到干冰乙醇浴 (dryiceethanolbath) 中将裂解液冷却到 5~10°C。通过持续搅拌和定时将管路从冷浴 (coolingbath) 中移出来减少裂解液在收集管底部和边上的冻结。
(3)4°C、15000 g 离心 30 min 裂解液。倾倒出上清液并用 Miracloth(EMDBiosciences-Calbiochem，Gibbstown,NJ;www.emdbiosciences.com) 将之过滤到另一个容器中，小心不要搅动沉淀。可溶组分按照随后的分离步骤对颗粒的忍耐度可以用较小孔径的低蛋白质吸附的滤器进行进一步澄清。最终澄清的上清液中含有菌体蛋白质的可溶组分，并且可以用于进行色谱层析或其他下游的分离或分析操作。
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