融合蛋白酶解实验

实验方法原理

实验材料 1 mg／ml 融合蛋白

试剂、试剂盒 200 μg Xa 因子／ml 反应缓冲液2 × SDS 样品缓冲液

仪器、耗材 沸水浴

实验步骤

1. 准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间。

反应 1:20 μl 含有 1 μl 200μg /ml Xa 因子的 1 mg/ml 融合蛋白

反应 2:5 μl 不含 Xa 因子的 1 mg/ml 融合蛋白（模拟消化）室温下反应。

2. 分别在 2、4、8 和 24 h 取出 5 μl 反应液，加 2 × SDS 样品缓冲液 5μl ，-20℃ 下冻存。

3. 在 24 h 时，将 5 μl 反应 2 （模拟消化）液与 5 μl 2 × SDS 样品缓冲液混合。

4. 将 5 μl 原始融合蛋白溶液与 5 μl 2 × SDS 样品缓冲液混合（未裂解对照）。

5. 将所有样品于沸水浴中加热 10 min，加样到 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，根据裂解程度确定适当的温育时间。如果仅出现明显的部分裂解，应增加酶的用量和（或）延长温育反应时间。如未发生裂解，则依据辅助方案进行。

6. 确定了适当的裂解条件后，将余下的融合蛋白样本按比例扩大反应，仅留小量的未裂解融合蛋白作对照用。以 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳监测裂解程度。

注意事项

经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化的融合蛋白，可在 PBS 缓冲液中进行 Xa 因子消化。或者将蛋白质溶解在 20 mmol/L Tris • Cl（pH 8.0）/ 1mmol/L CaCl2/ 100mmol/L NaCl 中。尽管大多数融合蛋白可保存于 4℃，但直至步骤 6，应将其保存在 10% 甘油中于 -70℃ 下储存。