6. 转基因的生化分析
( 1 ) 对转基因和非转基因植株的整株或不同的器官进行转基因的生化分析，如 GUS 分析（图 10.2 (e )~（h ) ; [ 48 ] ) 。
( 2 ) 为去除叶绿素，将绿色组织先在 70% 乙醇中浸泡 2 h，然后在 100% 乙醇中过夜处理（此步骤应在在 37℃ 孵育后进行）。
( 3 ) 抽真空以去除组织中的气体。
( 4 ) 将样品浸入 GUS 底物中 [ 10 mmol/L EDTA (pH 7.0 ) 、0.1 mol/L NaPO4 (pH 7.0)、1~5 mmol/L X-Gluc；X-Gluc 可溶解在二甲基亚砜中；Sigma] , 抽真空后立即在 37°C 孵育（57 ) 。
( 5 ) 为了观察 GUS 表达部位，制作徒手横切片，然后在 Zeiss SV8 体视镜或 Zeiss Axioskop 常规显微镜下观察。
7. hva1 转基因植株在胁迫条件下的评价
(1) 离体培养条件下的盐胁迫
① 取转基因和非转基因每个株系 50 或 60 粒种子的种子；见注 12) 进行表面消毒。每皿 MS7 培养基（25 ml/皿）上播 10~12 粒种子，于 25°C 暗培养萌发 4 天（见注 13)。非转基因的种子用不加草胺膦或双丙胺膦的 MS7 培养基。
② 将萌发种子分为两组，一组不加盐胁迫而另一组生长在盐胁迫条件下。
③ 从每一独立的转基因和非转基因株系中移出 4~5 棵正在生长的苗到加有 NaCl 或没有 NaCl 的 MS8 培养基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25°C 和 60 μmol/( m2·s ) 的光照条件下生长。最少 4 个重复。
④ 6 天后，观察转基因和非转基因植株在加盐和不加盐条件下的生长状况 [ 图 10.2 ⑴ ] 。
⑤ 进行了测定，如植株鲜重（见注 14 )、株局、根长、干 重（见注 15；表 10. 3) 。
⑥ 对数据进行方差分析 [58]。
⑦ Tukey's 差距检测法在 95% 置信度水平上比较均值。
⑧ 将植株移栽至泥炭：珍珠岩（1 : 1，V/V ) 混合的混合土中，并在温室中进一步生长。
(2) 温室（盆播）条件下的盐胁迫
① 依照 3.7.1 节中的方法在 MS7 培养基上萌发种子。
② 将 1 周大小经过筛选的转基因苗和非转基因对照苗移到小盆（8 cmx 4 cmx 6 cm) 中的混合土中，该混合土中泥炭：珍珠岩为 1 : 1 (每盆一株苗）。
③ 将这些盆放在加水的平底盘中，并在温室中生长 1 周。
④ 将生长中的苗分成 5 组，每组中转基因和非转基因株系分别取 8~10 棵苗。在盐胁迫处理前测定每一株的株高和叶数。
⑤ 用不同浓度的盐溶液 （0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L 和 200 mmol/L NaCl) 浇灌植物，每天一次持续 14 天（见注 16)。
⑥ 随后用水浇灌 1 周让植株恢复。
⑦ 之后，重新不间断进行 5 周盐胁迫处理。
⑧ 实验至少进行 4~5 次重复。
⑨ 测定单株株高、根长、分蘖数、单株结实率。比较转基因和非转基因植株在胁迫和非胁迫条件下的生长差异 [见注 1 7 ; 图 10. 2( j ) 和图 10. 2 ( k ) ] 。
⑩ 对数据进行方差分析统计 [58]。
⑾ Tukey's 差距检测法在 95% 置信度水平上比较均值（表 10.4 ) 。
(3) 离体培养条件下缺水或渗透胁迫
① 参照 3. 7 .1 节的方法，在 MS7 培养基上萌发种子（R。、R1 、R2) (见注 18)。
② 将萌发的种子分成两组：一组生长在不缺水或没有渗透胁迫的条件下，另一组生长在缺水或有渗透胁迫的条件下（见注 19)。
③ 将每一独立的转基因和非转基因株系的 4~5 株苗移到 Magenta 盒中加有甘露醇或没有甘露醇的 MS9 培养基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25℃ 光照条件下生长。最少 4~5 个重复。
④ 6 天后，分析转基因和非转基因植株在渗透胁迫和非渗透胁迫条件下的生长状况。
⑤ 和盐胁迫条件下一样对植株的生长状况进行测定。比较转基因和非转基因植株在胁迫和非胁迫条件下的生长差异（表 10. 3) 。
⑥ 将植株移栽到混合土中，其中泥炭与珍珠岩按 1 : 1 ( V /V ) 混合，使其在温室中进一步生长。
(4) 温室（盆播）条件下缺水胁迫实验
① 参照 3. 7 .1 节的方法，在 MS7 培养基上萌发 30~40 粒种子(见注 20)。
② 将 1 周大小的、经过筛选的转基因苗与未经筛选的非转基因苗作对照，移到装有混合土的小盆中（8 cmx4 cmx6 cm) ，该混合土为泥炭与珍珠岩 1 : 1 混合，每盆栽一株苗。
③ 将盆放置于加水的平底盘中，缺水处理前让植株在温室中生长 2 周。
④ 将植株分成加水（a 组）和缺水（b 组） 两组，每一组中转基因和非转基因株系各用 8~10 棵苗。在胁迫处理前测定每一株的株高和叶片数。
⑤ 在 a 组植株的平底盘中加水，持续 1 周。
⑥ 在 b 组植株的平底盘中只加水 2 天。
⑦ 加水 2 天后，完全去除 b 组平底盘中的水，以后的 1 周内处于缺水环境。
⑧ 重复这一过程 5 周。
⑨ 结束后，测定每一株的株高分蘖数。比较转基因和非转基因植株在胁迫和非胁迫条件下的生长差异。
⑩ 用方差分析进行数据统计 [58]。
⑾ Tukey's 差距检测法在 95% 置信度水平上比较均值。
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