12、蛋白降解
分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the
proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the
P.pastoris culture medium.
1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich
supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product
degradation possibly by acting as execess substrates for one or more
problem proteases.
2）、 The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the
culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that
portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.
连续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。
13、换液
通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，
10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMGY发酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，装量25ml)中诱导发酵.
BMGY和BMMY的换液方式有2种：
1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2）一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管（因为比较长，不容易引起污染）。当然，微量的如200ul，还是用移液器加（快而准确），可以在瓶口处往瓶内加入100％甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
14、上罐表达
放罐时OD能达到400左右，生长过程最高OD500左右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD约40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到最高约500。开始诱导后，起初3－5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%左右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut＋型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L，最终OD值约为最高OD值的80%左右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。
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