基因的转移与重组体的筛选和鉴定-3

2. 定向克隆

使目的基因按一定的方向插入载体的克隆方案称为定向克隆。最常用的定向克隆方案使用两种限制性内切酶切割载体和目的基因，从而在载体和目的基因两端产生非同源互补的两个粘性末端。定向克隆也可以通过在一端造成平端，另一端产生同源粘性末端实现年-平连接。

定向克隆有效的限制了自身环化，并且实现了目的基因的定向插入，在基因克隆，尤其是表达某一基因时，极为有用。定向克隆的连接体系与相应的粘性末端或平末端连接相同。

（1） 平末端连接

T4DNA连接酶能催化限制性内切酶切割产生的 DNA平末端进行连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供使用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将粘性末端变为平末端，再用T4DNA连接酶。

平端连接比粘性末端连接效率低很多，但具有普适性，可适用于任何DNA片断间的连接，是非常有用的基因克隆策略。另外，平端连接还常用于将人工合成的人工接头连接到DNA末端，为进一步的克隆奠定基础。

平端连接的主要缺点是连接效率低和存在多拷贝的插入，为此，在平端连接时。需采用高浓度的DNAA和连接酶，同时，在连接体系中加入低浓度的聚义二醇类物质，也可有效提高连接效率。多拷贝插入的缺点。可通过控制插入片断与载体的墨尔比解决。

（2） 同聚物加尾

同聚物加尾法就是利用末端转移酶分别在载体分子及外源双链DNA片段的3’末端各加上一段寡聚核苷酸，人工制成粘性末端。外源DNA片段和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，它能够催化脱氧核苷三磷酸逐个地加到DNA分子的3-OH末端，反应中不需要模板的存在，4种dNTP中的任何一种都可以作为它的前体物。因此，当反应混合物中有一种dNTP时，就可以将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3-OH上，行程仅由一种核苷酸组成的尾巴。

（3） 人工接头连接法

人工接头连接法可分为两种：一种为DNA连接法（linker）,另一种是DNA 接头法(adapter)。

1. DNA连接子法：DNA连接子是一段人工合成的具有平头末端的双链寡聚脱氧核苷酸片断，长度一般为8~12个，其上有一个或数个限制性核酸内切酶的识别位点。由此可以看出，DNA连接子的作用主要是在DNA末端天加一个限制性内切酶识别位点，已产生粘性末端，已利用DNA片断连接。主要使用于对平末段的改造和连接。

2. DNA 接头法: 尽管DNA人工连接子技术具有许多优越性，但也存在一些弊端。如靶DNA内部含有与连接子相同的识别序列时，在进行限制性核酸内切酶切割之前，必须进行甲基化，以保护靶DNA不被破坏。这一系列步骤，使得DNA连接子技术操作较为烦琐。

DNA接头是一段人工合成的一端或两端为粘性末端的DNA序列，其中包含一个至多个限制性核酸内切酶位点。接头法克服了连接子仅适用于平端改造的缺点，可以平端与目的基因连接，也可以粘性末端与目的基因连接。

（4） T-A克隆

目前T-A克隆是用来直接克隆PCR产物的方便方法。其原理是：由于TaqDNA聚合酶在扩增目的基因的同时，可以不依赖于模板而在产生的两端加上两个游离的“A”，因而只要载体切口处人工加上游离的“T”，PCR产物即可与载体连接。T-A克隆载体已被广泛应用，并已成为商品化载体。

第三节克隆的筛选与检测

在基因克隆、DNA文库制备过程中，外源DNA与载体连接、载体转化宿主细胞或体外包装的载体中，往往有一部分是没有外源DNA的，来自自我载体的空荷载体。如何从克隆的群体中排除假阳性的重组子，如何从成千万的重组子中筛选出所需要的目的克隆，如何证明选择的克隆含有所需要的目的基因？所以筛选是克隆目的基因的重要步骤。筛选的目的就是挑选出含有目的序列的重组体。
（一） 重组克隆的初步筛选

克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克隆的检测逐步深入、精确。

1. 重组克隆的遗传学检测

遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。重组子的表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。根据这两类表征对重组子进行初步筛选。

重组子的筛选含有两层含义：（1）把携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来；（2）把携带有特定外源插入片段的重组子挑选出来。

(1) 抗药性筛选

这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenicol，Cm或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，Kn或Kan）；四环素（tetracymic，Tc或Tet）；链霉素（strentomycin，Sm或Str）。

重组质粒DNA携带特定的抗药性基因，转化后赋予受体菌在含有相应抗生素的培养基上正常生长，而不含此载体的DNA的受体菌不能存活。在质粒载体中通常使用双抗药性标记。

例如：以质粒载体pBR322为例，pBR322含有Tetr和Ampr两个抗性基因。非重组的野生型pBR322应该表现出对Tet和Amp两种抗生素的抗性活性。能在其中之一下生长的受体菌，说明其受体细胞已被转化。

（2）插入失活筛选法

检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗药性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的抗药性进行再次筛选。

如：pBR322有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。