（2）Chadwick氏法
试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01 mol/L pH8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶(25 ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500 ml)透析袋、棉线、玻棒等。
方法及步骤：
①抗体准备：用0~4 ℃的pH 8.0磷酸盐缓冲盐水将抗体蛋白溶液稀释至浓度为30~40 mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。
②荧光素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01 mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光素溶液等量混合，充分搅匀，在0~4 ℃冰箱中结合18~24 h。
④透析和柱层析：方法同Marshall氏法。
（3）改良法
试剂：
①0.01 mol/L pH7.2 PBS配法：NaCl 18 g、Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g，溶于2000 ml蒸馏水中，校定pH至7.2。
②0.5 mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5 mol/L Na2CO3（5.3%）10 ml加入0.5 mol/L NaHCO3（4.2%）90 ml，混匀后，校定pH至9.0。
③3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
方法及步骤：取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15 mol/L NaCI）及缓冲液（0.5 mol/L
NaHCO3-Na2CO3 pH 9.0）稀释使每ml内含抗体10 mg，缓冲液为总量的10%，降温至4
℃，加入异硫氰酸荧光素，(蛋白：荧光素=80 mg:1 mg)，在0~4 ℃下电磁搅拌12~14
h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler氏试剂测验至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%，分装在1
ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4 ℃）可以用半年以上，-20 ℃保存可达2年以上。
2、四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
（1）取IgG10 ml（6 mg/ml）在0.1 mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。
（2）将四甲基异硫氰酸罗达明（每毫克IgG加入5~20 g）溶于二甲亚砜（1 mg/ml），取此溶液300 ml,一滴一滴加入抗体溶液中，同时电磁搅拌。
（3）在室温中搅拌2 h，避光。
（4）把结合物移入直径3 cm，高30 cm大小的Bio-Gel P-6层析柱，用0.01 mol/L pH 8.0的PBS平衡过柱，流速为1.5 ml/min。
（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4 ℃保存备用。
3．藻红蛋白标记抗体方法
（1）巯基化藻红蛋白（phycoerthrin，PE）的制备600 μl的15.5 mg/ml盐酸巯醇亚胺（iminothiolane
hydrochloride）加到1.2 ml的3.6 mg/ml的PE中，和1.2 ml PB（pH 6.8）混合，装入透析袋置入50
mmol/L pH 6.8 PB中透析，4 ℃过夜，再换用pH7.5 PB透析6 h。每个PE分子中可结合8个巯基。
（2）巯基PE-IgG制备 异双功能试剂SPDP[N-Succinimdyl 3-(2-pyridyldithio) propionate]
30 g（1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700 μl的4.2 mg/ml IgG PB溶液（50 mmol/L pH
7.5），在室温中反应2.5 h。再加入巯基化PE400 μl（1.7 mg/ml）加到500 μl反应混合液中，室温反应12 h，加入100
μl的50 mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，在4 ℃用PB透析过夜。加入0.01%NaN3分装，4 ℃保存半年。
（3）PE-标记蛋白A方法
①取4.08 mg PE 溶于0.1 mol/L pH 7.4 PB（含0.1 mol/L NaCl）1 ml中，溶解后，取出0.5
ml，再加入10 μl SPDP无水甲醇液（2.6 mg/ml），SPDP/蛋白摩尔比为10，22 ℃反应5 min，过Sephadex
G-50（1×17 cm），用100 mmol/L pH 7.4 PBS（含0.1 mol/L NaCl）平衡和洗脱。
②0.5 ml蛋白（2 mg/ml）100 mmol/L PBS（含有100 mmol/L NaCl pH 7.4），加入2.6
μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白A=9：5 ，22 ℃，40 min，加入25 μl二硫苏糖醇（DTT）pH 7.4缓冲液，22 ℃，25
min，同上过sephadex G-25，收集蛋白A峰。
③取0.77 mg/ml的PE和0.27 mg/ml蛋白A等量混合，22 ℃反应6 h，混合物4
℃保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01 mol/L pH 7.4 PB（含有0.1 mol/L EDTA、1 mol/L
碘乙酰胺、1% BAS和0.1% NaN3），0~4 ℃保存。
4．蓝色荧光素标记抗体方法
Kbaffan 等(1986)首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。
（1）取7-氨基-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin，AMC）260 μg溶于二甲亚砜25 μl中。
（2）将上液加入10 ml IgG-巴比妥缓冲液（0.5 mol/L，pH 8.5，内含50~100 mg IgG）中，室温反应2 h，过Sephadex G-50除去游离荧光素, 最大荧光波长430 nm，最大吸收波长354 nm。
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