实验流程:
1. 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心,用PBS清洗。
2. 用100μl 裂解缓冲液冰浴溶解沉淀10min(每500000个细胞20μl裂解缓冲液)。
3. 10000rpm,4°C离心10min,取上清转移至新管。
4. 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。
5. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml,每小瓶中放100μl,-80°C储存。
6. 按照1:1体积比混合2×样品缓冲液,煮沸5min后,室温放置5min。
7. 短时离心后点样电泳检测。
溶液准备:
裂解缓冲液:
0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 异丙醇和
5mM ε-氨基己酸
2×样品缓冲液:
130mM Tris-HCl(pH8.0), 20%(v/v)甘油, 4.6%(w/v)SDS, 0.02%溴酚蓝, 2%DTT
PBS(pH7.4):
10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl