qPCR 常见问题解答

　　通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80～150 bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。

　　SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

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　　今天给大家汇总一下 qPCR 常见问题。

　　1、无 Ct 值出现

　　检测荧光信号的步骤有误：一般 SG 法采用 72℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

　　引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性。

　　模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

　　模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

　　2、Ct 值出现过晚（Ct>38）

　　扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

　　PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。

　　PCR 产物太长： 一般采用 80～150 bp 的产物长度。

　　3、标准曲线线性关系不佳

　　加样存在误差：使得标准品不呈梯度。

　　标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

　　引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。

　　模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

　　4、负对照有信号

　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

　　模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　5、扩增效率低

　　反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

　　反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

　　反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

　　6、扩增曲线异常，比如 S 型曲线

　　参比染料设定不正确：MasterMix 不加参比染料时，选 NONE。

　　模板的浓度太高或者降解。

　　荧光染料的降解。

　　7、定量 PCR 仪的开关机顺序是怎样的？

　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量 PCR 仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量 PCR 的收集软件，进行实验。

　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR 仪主机的电源，最后关闭电脑。

　　8、什么是 CT 值比较法？数据怎么处理？

　　CT 值与起始 DNA 浓度的对数成反比：

　　如果：不同管之间的 PCR 反应效率相同。这些 PCR 的反应效率接近 100%。可以从上面的公式推出相对含量（X01/X02） = 2 -ΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后 0、24、48 小时 IL-2 基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的测定结果都是 CT 值，而没有通过标准曲线测定总 RNA 的 pg 数。

　　9、定量 PCR 基因表达的实验数据应该如何处理？

　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。

　　参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的 ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映 PCR 进程。ROX 校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。

　　内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同时定量一个内对照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。

　　计算相对于基准样品（Calibrator）的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0 小时和 6 小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6 小时/0 小时、患病/正常。

　　10、怎样判断定量 pcr 仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？

　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。

　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行 ROI 的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。

　　清除样本加热块污染的步骤如下：

　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。

　　吹打数次。

　　将废液吸入废液杯中。

　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。

　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。

　　11、内标法和外标法哪种数据更精密？

　　是同样可靠的。

　　内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR 效率有差异。

　　外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的 PCR 效率有差异。

　　两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

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