细胞化学染色检验（三）

【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞质中出现蓝色沉淀。
1． 原粒细胞阴性或阳性，早幼粒细胞至成熟中性粒细胞呈阳性反应，不被氟化钠抑制。
2． 原始单核细胞阴性或阳性，幼单核细胞和成熟单核细胞均呈阳性，能被氟化钠抑制。
3． 淋巴细胞阴性或阳性，不被氟化钠抑制。
4． 巨核细胞、血小板均呈阳性。
5． 早期幼红细胞呈阳性，随着细胞的成熟阳性程度逐渐减弱、此反应不被氟化钠抑制。
【临床意义】临床意义基本同α-NAE染色，可用于辅助诊断急性白血病类型。
1． 急性单核细胞白血病，单核系细胞阳性，此反应能被氟化钠抑制。急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性，氟化钠抑制率与两类细胞的比例相关。
2． 急性粒细胞白血病之原粒细胞可阳性，此反应不被氟化钠抑制。急性早幼粒细胞白血病，颗粒异常增多的早幼粒细胞呈强阳性，此反应不被氟化钠抑制。
3． 急性淋巴细胞白血病，白血病细胞呈弱阳性或阳性，此反应不被氟化钠抑制。
4．酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)
【原理】血细胞中的酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)在PH弱酸性（PH5.8）的条件下，水解基质液中的α-醋酸萘酚，产生α-萘酚，萘酚与六偶氮付品红形成红色的沉淀。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞中出现蓝色沉淀。
1． 单核系细胞常呈强阳性。
2． T淋巴细胞阳性，B淋巴细胞多数为阴性。
3． 粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞含量较少。
【临床意义】酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)染色主要用于单核细胞白血病与其他白血病的鉴别。
1． 急性单核细胞白血病呈强阳性（弥散分布）。
2． 急性粒细胞白血病常呈阴性或弱阳性，急性早幼粒细胞白血病呈较强阳性反应（弥散分布）。
3． 急性T淋巴细胞白血病时，常呈点状颗粒或块状阳性。
4． 临床曾用于鉴别T、B淋巴细胞，现在T、B淋巴细胞的鉴别主要用流式细胞仪进行，所以该染色法已很少采用。用于T、B淋巴细胞的鉴别时，成熟T细胞呈点状颗粒或块状阳性，B细胞大多阴性，偶见稀疏、弥散的细小颗粒。

5. 酯酶双染色
在同一张涂片上进行两种酯酶染色称为酯酶双染色。可采用特异性酯酶和一种非特异酯酶染色。常用的为氯乙酸AS-D萘酚酯酶和α-萘酚丁酸酯酶。反应原理基本上与各自的染色原理，同一张涂片上的血细胞要分别在两种不同的基质液中反应一段时间，然后复染观察。酯酶双染色时，急性粒－单细胞白血病同一张涂片上出现两种酯酶染色阳性的细胞，或者同一种细胞呈现两种酯酶染色阳性，而其他急性白血病不具备此特征，因此酯酶双染色对辅助诊断急性粒－单细胞白血病有独特的价值。 返回
四、过碘酸－雪夫染色（periodic acid-Schiff staining PAS）
【原理】过碘酸-碱性品红中的过碘酸是氧化剂，可以打开多糖类物质（糖原、糖蛋白、粘多糖、粘蛋白及糖脂）的乙二醇基CHOH-CHOH，形成双醛基（CHO-CHO），后者与雪夫试剂(schiff)中的无色碱性品红结合成紫红色化合物。
【染色结果及正常血细胞反应】PAS阳性结果：胞浆内出现紫红色颗粒、珠状、块状或片状，细胞核为蓝色。
1． 粒细胞系统：分化差的原始粒细胞为阴性，分化好的原始粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，随着细胞的成熟，阳性反应程度逐渐增强，阳性呈细颗粒、均匀红色；嗜酸性粒细胞中的嗜酸性颗粒不着色，颗粒之间的胞质呈红色，嗜碱性粒细胞中的嗜碱性颗粒呈阳性，而颗粒之间的胞质不着色。
2． 红细胞系统：幼红细胞及成熟红细胞均呈阴性。
3． 单核细胞系统：分化差的原单细胞为阴性，其他呈阳性，大多数阳性为细颗粒状，有时分布于细胞边缘的颗粒较粗大。
4． 淋巴细胞系统：大多数阴性，少数阳性，阳性颗粒呈粗颗粒或珠、块状。
5． 巨核细胞系统：巨核细胞、血小板阳性，呈粗颗粒或珠、块状。
6． 其他细胞：浆细胞一般阴性，少数阳性，呈细颗粒状；巨嗜细胞可为阳性，呈细颗粒状。

图7 ALL PAS呈珠状和块状 图8 M3细胞PAS易见柴束状结晶

图9 AHL PAS 图10 高雪细胞PAS呈强阳性

【临床意义
1． 急性淋巴细胞白血病：原、幼淋细胞PAS阴性或阳性，阳性率升高，阳性反应物多呈中粗颗粒、粗颗粒散在分布；珠状和块状围绕核周(图7)。慢性淋巴细胞白血病时淋巴细胞的阳性率增加，呈粗颗粒状或块状；恶性淋巴瘤时淋巴瘤细胞阳性率高、阳性强、呈块状或粗颗粒状；Reed-Sternberg细胞则为弱阳性或阴性反应。
2． 急性粒细胞白血病：原粒及早幼粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应物多为细颗粒弥散状。异常早幼粒细胞的PAS反应呈强阳性，阳性反应物为密集的细颗粒弥散状，胞浆边缘及外浆处多分布粗大颗粒，大部分病例细胞胞浆内易见柴束状结晶(图8)，少数病例在细颗粒弥散状基础上可见1～2个小珠。
3． 单核细胞白血病：原、幼单核细胞PAS较粒细胞强，阳性反应呈细颗粒弥散分布，部分夹杂中粗颗粒、粗颗粒，胞质边缘及伪足处呈大粗颗粒，少部分在此基础上可见小珠，少数可见裙边样反应。
4． M4EO异常嗜酸粒细胞：PAS可见深粉红色小珠。ANLL Auer小体PAS阳性。
5． 微分化型AL(M0)：PAS可为细颗粒、中粗颗粒散在分布；部分在此基础上可见小珠。
6． 红细红胞系统疾病：红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中幼红细胞可阳性（呈均匀红色或块状），有时幼红细胞阳性反应强且阳性率高，甚至红细胞也呈阳性。在某些红系良性疾病，如缺铁性贫血、地中海贫血中幼红细胞可阳性，有时阳性率也较高；巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等幼红细胞可阴性，有时个别细胞可呈阳性。
7． 巨核细胞白血病：原始巨核细胞PAS呈阴性或阳性反应，部分为细颗粒弥散状，部分表现为强阳性，阳性反应物为中粗颗粒、粗颗粒散在分布，部分可见小珠或块状。小巨核细胞PAS呈细小颗粒弥散状，边缘处为粗颗粒及小珠。
8． 嗜碱粒细胞白血病的嗜碱粒细胞PAS为强阳性，阳性物多表现粗颗粒、珠状、块状。与幼稚淋巴细胞PAS较难鉴别。
9． AHL： PAS部分细胞呈细颗粒弥散状，部分细胞呈粗颗粒、珠状(图9)。
10． 浆细胞PAS弱阳性，一般呈淡粉色看不清颗粒，极少数病例可见粗颗粒和小珠。
11． 高雪细胞PAS呈强阳性反应(图10)；尼曼-匹克细胞为阴性或弱阳性，空泡中心阴性。以此鉴别高雪细胞和尼曼-匹克细胞。
12． 骨髓转移瘤细胞PAS大部分呈强阳性；腺癌细胞PAS呈强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。
13． 组织嗜碱细胞PAS强阳性，细颗粒弥散状，部分可见大粗颗粒。 返回
五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色(neutrophilic alkaline phosphatase,NAP)
【原理】中性粒细胞碱性磷酸酶 (neutrophilic alkaline phosphatase,NAP)染色的方法有Gomori钙－钴法和Kaplow偶氮偶联法。Gomori钙－钴法染色原理是碱性磷酸酶在碱性条件下将基质操作液中的ß－甘油磷酸钠水解，产生磷酸钠，磷酸钠依次与硝酸钙、硝酸钴、硫化胺产生一系列反应，形成不溶性棕黑色沉淀，定位于酶活性所在部位。较为繁琐、所需时间长。
Kaplow偶氮偶联法：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在PH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。该方法为目前所常采用。不同的底物与重氮盐的组合不同，化学反应过程以α-醋酸萘酚钠为例
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞质中出现不溶性灰黑色到棕黑色颗粒。NAP主要存在于中性成熟粒细胞（包括中性杆状核粒细胞和分叶核粒细胞），呈阳性反应，其他细胞基本呈阴性。反应结果以阳性反应细胞的百分率和积分值来表示。反应强度分为5级，其分级及积分值如下：
－，0分，细胞质中无阳性反应颗粒。
＋，1分，细胞质中含少量阳性反应颗粒或细胞质呈弥漫浅灰色。
2＋，2分，细胞质中含中等量阳性反应颗粒或细胞质呈弥漫灰黑色。
3＋，3分，细胞质中含较多阳性反应颗粒或细胞质呈弥漫棕黑色。
4＋，4分，细胞质中充满粗大阳性反应颗粒，甚至遮盖细胞核，或细胞质呈弥漫深黑色。 
血液涂片经染色反应后，在油浸镜下，连续观察100个成熟中性粒细胞，记录阳性反应细胞所占百分率即为阳性率；并对所有阳性反应细胞逐个按其反应强度作1＋～4＋的分级，将各级所占百分率乘以级数，相加即为积分值。通常成人NAP阳性率10～40％；积分值40～80分。注意不同的观察者的记分标准有所不同，结果易受主观因素影响，因此参考值变化较大。NAP积分明显增高或明显减低者，临床意义较大，同时应排除生理性影响。
图11 为不同阳性反应强度的示意图

图11 中性粒细胞碱性磷酸酶染色：1.中性粒细胞胞浆呈弥漫浅灰色（+）， 2.胞浆中有稍致密的棕黑色片状沉淀（2+）， 3.胞浆中充满棕黑色颗粒（3+）， 4.胞浆中充满棕黑色颗粒，并有一部分遮盖了细胞核，（4+） 5.淋巴细胞。
【临床意义】
1． 生理性变化
（1） 年龄变化：新生儿NAP活性增加，以后下降。儿童各年龄段相似，成人较儿童活性减低，老年期更低。
（2） 应激状态：紧张、恐怖、激烈运动等NAP活性可增加。
（3） 月经周期中的变化：经前期增高，行经后减低，经后期恢复。
（4） 妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月高，分娩时达高峰，产后恢复正常。
2． 病理性变化
（1） NAP积分增加：见于细菌感染、再生障碍性贫血、某些骨髓增殖性疾病（如慢性中性粒细胞白血病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症），慢性粒细胞白血病之加速期及急变期，急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移瘤、肾上腺糖皮质激素、ACTH治疗后等。
（2） NAP积分下降：慢性粒细胞白血病慢性期，阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等。
3． 疾病的鉴别
（1） 类白血病反应与慢性粒细胞白血病：前者明显增加，后者明显下降且积分常为零。
（2） 慢性粒细胞白血病慢性期与慢性中性粒细胞白血病：前者明显下降且常为零，后者明显增加（常在300分以上）。
（3） 细菌感染与病毒感染：前者明显增加，后者在正常范围或略降低。
（4） 再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿：前者常增加，后者常下降。
（5） 急性白血病类型鉴别：急性粒细胞白血病常下降，急性淋巴细胞白血病常增加，急性单核细胞白血病一般正常或减低。
（6） 恶性组织细胞病与反应性组织细胞增多症：前者常下降，后者无明显变化。
（7） 真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症：前者常增加，后者无明显变化。
（8） 原发性血小板增多症与继发性血小板增多症：前者常增加，后者无明显变化。 返回
六、酸性磷酸酶（Acid phosphatase ACP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase TRAP）染色
【原理】酸性磷酸酶与细胞的许多生理功能和病理变化有关。用聚丙酰胺凝胶电泳发现，血细胞的ACP由7种同功酶组成(ACP 0,1,2,3,3b,4,5)。同功酶0存在高雪细胞、单核细胞和巨噬细胞；1、2、4中性粒细胞；1、4单核细胞；3b各型AL的原始细胞内；3淋巴细胞；5 毛细胞，具有独特的抗酒石酸的功能，是HCL所特有的；也有提示高雪、巨噬细胞也有。在某些血液病时，同功酶的出现与疾病特点和占优势的细胞类型有关。酸性磷酸酶染色法有硫化铅法和偶氮偶联法。硫化铅法的染色原理为血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下（PH5.0）将基质液中的ß－甘油磷酸钠水解，产生磷酸根，磷酸根与硝酸铅作用生成磷酸铅，定位于胞浆中的磷酸铅再与硫化铵反应生成棕黑色硫化铅沉淀。偶氮偶联法的染色原理为血细胞内的酸性磷酸酶能使底物磷酸AS-BI萘酚水解，释放出不溶性萘酚，后者与偶氮染料坚固石榴红结合，形成紫红色颗粒沉淀于胞质内。
抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase） 染色 用相同方法制备两分基质液，一分加入适量的L-酒石酸（tartaric acid），另一分不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液作酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐酒石酸，两张均呈阳性；如不耐酒石酸，则不加L-酒石酸者呈阳性，加L-酒石酸者呈阴性反应。
【染色结果及正常血细胞反应】硫化铅法的阳性反应为棕黑色硫化铅沉淀，偶氮偶联法阳性反应为紫红色颗粒。粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨嗜细胞呈阳性（图12）。
【临床意义】
1. 帮助诊断多毛细胞白血病（hairy cell leukemia HCL）：多毛细胞白血病时多毛细胞ACP呈阳性或强阳性反应，且其活性不被L-酒石酸抑制，有助于本病的诊断（图13，14）。
2. 帮助鉴别T和B淋巴细胞：在人体发育中，T淋巴细胞的酸性磷酸酶出现在发育早期胸腺细胞阶段，并持续到成熟。定位于Goigi器中，所以大多数急性和慢性T淋巴细胞增生疾病都表现ACP活性，阳性物多呈颗粒型，也可以为阴性，以T-ALL的反应最强，B淋巴细胞增生的ACP反应弱阳性或阴性.
3. 高雪细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别：高雪细胞ACP呈强阳性反应；并具有抗酒石酸功能。尼曼-匹克细胞呈阴性或弱阳性反应。
4. 急性髓系白血病的ACP反应：原始单核和幼稚单核细胞ACP为强阳性反应；原粒细胞对ACP反应不一，早幼粒细胞和中幼粒细胞ACP较弱，异常早幼粒细胞较强。
5. 用于ALL和ANLL的鉴别：ALL阳性物多为颗粒型。ANLL呈弥散状。
6. 浆细胞ACP呈较强的阳性反应，阳性物为大粗颗粒和珠状散在分布于细胞浆内。
7. 转移瘤细胞强阳性。 返回

图12 酸性磷酸酶染色：1.巨核细胞 2.原始粒细胞 3.中性分叶核粒细胞 4.单核细胞 5.中幼红细胞 6.淋巴细胞。

图13 HCL ACP呈强阳性 图14 HCL TRAP阳性

七、骨髓铁染色（ferric stain）
【原理】正常骨髓中有一定量的铁，以含铁血黄素的形式存在于单核巨噬细胞系统细胞的胞浆中，称细胞外铁。中、晚幼红细胞胞浆中亦含有铁颗粒称细胞内铁或铁粒幼细胞。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。
【染色结果及正常血细胞反应】骨髓中出现蓝色颗粒为阳性。
1． 细胞外铁 观察骨髓小粒中的铁，呈弥散蓝色、颗粒状、小珠状或块状。按阳性程度分为5级（图15）。通常正常为1＋～2＋，大多为2＋。
“－”骨髓小粒上无蓝色呈现（提示骨髓储存铁缺乏）
“1＋”有少量蓝色颗粒，或偶见小珠。
“2＋”有较多的铁颗粒和铁小珠。
“3＋”有很多铁颗粒、小珠、和少数蓝黑色小块。
“4＋”有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。
2． 细胞内铁 观察幼红细胞内的铁。正常幼红细胞（主要是晚幼红细胞）的细胞周围可以见1～5个呈蓝色细小的铁颗粒。含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼细胞。在油浸镜下，连续计数100个幼红细胞，记录铁粒阳性的幼红细胞数，即为铁粒幼细胞所占的百分率。需同时注意细胞内的铁粒数目、大小、染色深浅和排列。如含粗大深染的铁粒数目在10个以上，并环绕细胞核排列超过核周径2/3以上者，称为环状铁粒幼细胞。铁粒幼细胞所占的百分率通常为20％～90％，平均值65％（由于各实验室的试验条件不同，参考值也有差异，各实验室应建立自己的参考值）。 
【临床意义】
1． 缺铁性贫血早期骨髓中的储存铁就已耗尽，细胞外铁呈“－”。铁粒幼细胞的百分率减低，<15％，甚至为“0”。经铁剂治疗后，数天内铁小粒出现在幼红细胞中，但细胞外铁需待贫血纠正一段时间后才会出现。因此，铁染色是目前诊断缺铁性及指导铁剂治疗的可靠和切合临床实用的检验方法。
2． 非缺铁性贫血如溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血及骨髓病性贫血等，细胞外铁多增加，常>3＋～4＋。肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等，细胞外铁明显增加而铁粒幼细胞可减少。
3． 铁粒幼细胞贫血时，因血红素（heme）合成障碍，铁利用不良，铁粒幼细胞增多，并可见到环状铁粒幼细胞，占幼红细胞的15％以上。骨髓增生异常综合征（MDS）中，难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多（RAS）这一类型，铁粒幼细胞也增多，环状铁粒幼细胞>15%。

铁染色“－” 铁染色“1＋

铁染色“2＋” 铁染色“3＋” 铁染色“4＋”
图15 铁染色的阳性度分级 返回
细胞化学染色小结
正常人血细胞以及白血病原始细胞的细胞化学特征
POX SBB esterases PAS ACP CE α-NAE α-NBE
原始粒细胞 －/+ －/+ －/+ －/+ _ －/+ _早幼粒细胞 +/2+ +/2+ +/2+ －/+ _ +/+ +/2+中幼粒细胞 2+ 2+ +/2+ －/+ _ 3+ + 单核细胞 －/+ －/+ －/+ 3+ 2+/3+ + 2+淋巴细胞 _ _ _ －/+ －/+ －/+ -/2+原始红细胞 _ _ _ －/+〔1〕 _ _ +/_ 巨核细胞 _ _ _ 3+ + 2+ 2+

POX SBB esterases PAS ACP CE α-NAE α-NBE
ALL － －/少数＋ － －/+〔2〕 － ＋/++典型为珠、块状 －/+〔3〕 HAL －/+ －/+ ＋可为小珠状AUL － － － － － － －M0 － － － －/+ 可为2＋，可为小珠状M1 －/+ －/+ － ＋/－ －/+ ＋ ＋/－M2a ＋ ＋ 多为－ －/+ －/ + ＋/－ －/+ M2b 2＋ 2＋ 2＋ 2＋ －/+ ＋/－ －/+M3 3＋ 3＋ 3＋ －/3＋ － ＋/－/2+细颗粒状 －/2＋M4 2+ 2+ 2+ 2+/3+NaF抑制 2＋ －/2＋ 2＋M5 －/+ ＋/－ ＋/－强于pox,SBB 3+ NaF抑制 3+ 2+ 2+M6 － － － 2＋ ＋ 2＋ －M7 －/ PPO+ － － ＋ －/+ 2＋ 2＋小巨核酶标＋MM ＋ ＋ 转移瘤 2＋ 3＋ 2＋

注释：－阴性，＋/－弱阳性，＋中等阳性，2＋中强阳性，3＋强阳性（多数细胞）
注〔1〕α-NAE在红白血病以及一些红系统成熟障碍疾病可表现为强阳性。
注〔2〕α-NAE在少数ALL的细胞浆出现点状阳性物，这类ALL倾向于T-ALL。
注〔3〕ACP在T-ALL为强阳性，在非T-ALL为弱阳性。