发展阶段/生物反应器

　　生物反应器（bioreactor）经历了三个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。转基因动物生物反应器的出现之所以受到人们极大的关注，是因为它克服了前两者的缺陷，即细菌基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻、成本太高而限制了规模生产。另外，转基因动物生物反应器还具有产品质量高、容易提纯的特点。一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫做动物生物反应器。几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可以经过人为驯化为生物反应器。从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要方便产物的获得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器、动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。

　　转基因动物生物反应器

　　用微生物、植物、动物或人细胞，或者用专一性酶通过生物方法将原料转化为特定产品的容器称为生物反应器。通常微生物和细胞又涉如何维持它们的环境以提供最佳的生长条件的问题。生物反应器能通过提供合适的条件：例如最佳温度、pH、有效的底物、营养盐、维他命和氧（对好氧有机物）来支持这个自然过程，使细胞能进行生长和新陈代谢。生物反应器（bioreactor) 经历了3 个发展阶段细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。细胞基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后，才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻，成本太高，限制了规模生产。动物生物反应器具有产品质量高，容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。

　　转基因动物生物反应器

　　转基因动物是指经人的有意干涉，通过实验手段，将外源基因导入动物细胞中，稳定地整合到动物基因组中，并能遗传给子代的动物。Palmiter等（1982）将含有小鼠金属巯蛋白基因启动子的DNA片断与大鼠生长激素基因融合，用微注射的方法导入小鼠受精卵，移植给受体，产下了21 只仔鼠，6 只比同窝仔鼠生长快，10周龄时体重比同窝正常鼠大1 倍，成功地获得了超级小鼠。这一结果引起世界轰动，转基因动物的内在潜力由此而得以证实。随后世界各国普遍开展了转基因动物的研究，目前已有转基因小鼠、猪、牛、鱼、鸡等多种转基因动物问世。转基因动物的主要技术步骤包括目的基因的分离与克隆；表达载体的构建；受体细胞的获得；基因导入；受体动物的选择及转基因胚胎的移植；转基因整合表达的检测；转基因动物的性能观测及转基因表达产物的分离与纯化；转基因动物的遗传性能研究以及性能选育；组建转基因动物新类群

　　等。转基因动物最为诱人的前景是利用它生产人类所需要的生物活性产品或药物。目前世界上有很多公司正在致力于这方面的研究。而转基因家畜研究最为活跃的领域就是利用它们生产新的动物产品。通常把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物称为动物生物反应器，把家畜作为一种生物反映器，生产人类所需的药用蛋白，包括治疗用药物、激素和抗体等。

　　动物血液生物反应器

　　近年来，动物血液生物反应器取得了很大进展。血液生物反应器比较适合生产人血红蛋白、抗体和生产非生物学活性状态的融合蛋白，而有活性的蛋白或多肽（如激素、细胞分裂素、组织血纤维溶酶因子等）由于进入了动物血液循环系统而影响动物的健康。到目前为止，已有多种通过转基因动物生产的具有生物学功能的人血红蛋白问世。

　　动物的乳腺生物反应器

　　乳腺生物反应器的原理是外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即引导泌乳蛋白基因表达的序列，将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白。从目前的研究成果看，与传统的原核系统及细胞发酵系统相比，动物乳腺生产的重组蛋白产品具有以下特点：生物活性高，无污染，纯化简单，产量高，成本低。目前，已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。大多数的乳蛋白基因的启动子已用于外源基因在转基因动物乳腺中的表达。s1-酪蛋白基因和-乳球蛋白的启动子尚有未知因素的作用，它们在转基因动物中表达水平低或表达不稳定。-酪蛋白的启动子在转基因动物中表达水平也很低。绵羊-乳球蛋白、山羊酪蛋白和牛s1-酪蛋白启动子在转基因动物乳腺中维持异种蛋白的表达水平较高。如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA，表达效果可能会更好。不翻译的外显子和内含子的掺入可能有利于

　　转基因的表达。值得一提的是，利用乳腺生物反应器生产的“新奇牛奶”已经问世。2003 年，Brophy 等通过共转染和嘌呤霉素筛选向牛胎儿成纤维细胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷贝，而后进行核移植生产出了8 头转基因奶牛，其产奶中酪蛋白总量较普通奶高30%。这种奶的蛋白和钙含量提高，热稳定性增强而乳糜颗粒变小，其营养价值更高，也更适于奶酪生产。

　　优越性

　　转基因动物的问世，为利用基因工程手段获得低成本、高活性和高表达的产物开辟了一条重要途径。作为生物反应器的转基因动物，主要是利用其乳腺组织和血液组织进行定位表达，特别是用乳腺组织生产具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养意义的蛋白质，已成为一个新兴的转基因制药业，它的优越性有如下几点。3.1 表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性利用DNA重组技术的微生物发酵工程来生产的药用蛋白,由于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工，因而生物活性低，并且具有免疫原性，而利用转基因动物生产药用蛋白却免除这些问题。

　　成本低可以大规模生产

　　作为生物反应器的转基因动物可无限扩繁，且饲养成本低，可进行大规模的药物生产。而动物细胞生物反应器，虽然能生产具有完全生物活性的产品，但以商业生产为目的的大规模的动物细胞培养，成本会极高且培养条件要求苛刻。

　　产品质量高易提纯

　　由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品，避免了化学试剂及生物毒素的污染。目前，某些药用蛋白生产已达每千克乳汁含几十克，生物活性与天然蛋白几乎完全一样，极易提纯。总之，动物生物反应器弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。

　　应用

　　以动物的乳腺或其它组织作为生物反应器生产贵重的医用蛋白，是动物转基因技术的另一特殊形式。由于转基因动物的遗传结构发生了变化，并能稳定地遗传给后代，外源基因不仅能在转基因动物得到整合和表达，而且能获得组织特异性（乳腺组织）和发育特性（妊娠后期和泌乳期）表达，利用这一点能产生转基因泌乳家畜，还能生产出目前短缺而又十分珍贵的医用蛋白。近十年，这方面的研究在英、美、法、瑞士和荷兰等国家已相继展开，并取得了一定进展。截至目前，世界一些国家的生物技术企业在利用转基因动物作生物反应器研究开发的转基因动物药品有以下几种。

　　组织纤溶酶原激活剂（TPA）：由美国遗传技术公司（Genentech) 用基因重组技术开发的血栓溶解剂，1987 年11 月经联邦食品及药物管理局（FDA）批准上市。1988 年的销售额为1.5 ～ 1.6 亿美元，1989年为1.8 ～ 1.9 亿美元。今后每年的市场销售额约为2 ～ 2.5 亿美元。

　　乳铁蛋白（lactoferrin): 用转基因奶牛生产。由于以转基因奶牛生产乳铁蛋具备产量高、成本低，以及有无限量增殖生化反应器等特征，因而备受各国瞩目。乳铁蛋白是一种口服的活性蛋白，自然产生于人乳中，它具有抗菌、传递铁素等特性。

　　人类-1 抗胰蛋白酶（AAT）：-1 抗胰蛋白酶（AAT）缺乏是最常见的遗传代谢病，能引起肺和肝的损伤。-1 抗胰蛋白酶（AAT）为呼吸系统的非特异性可溶因子，它可抑制多种酶的活性，包括细菌的酶，以及中性白细胞溶酶体分泌的蛋白质、弹性蛋白酶、胶原酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶。这项产品是从英国农业和食品研究委员会的动物生理和遗传研究院（IAPGR）研究成果为基础，近年由英国PPL 公司与德国拜耳公司共同尝试用转基因绵羊的羊奶生产AAT。

　　促红细胞生成素(EPO）：以转基因猪生产。这种药物存于转基因猪的血液中。目前转基因猪血球素合成的遗传控制机制已十分清楚，用基因重组技术合成的EPO 已在多个国家上市。

　　重组人抗凝血酶ii（i atryn）：世界上第一个动物乳腺生物反映器重组蛋白药物。Atryn的主要成分-重组人抗凝血酶iii 具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显着效果。拒美国权威机构预测，到2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额将达到350 亿美元，生产的药物将占整个基因工程药物种类的90%以上。

　　存在的问题与发展前景

　　转基因动物与生物反应器是20 世纪生命科学发展的一个里程碑，但现在仍然存在着许多急需解决的问题。由于转基因动物的研究在理论和技术上尚有不完善之处，使得转入的外源基因在动物基因组中随机整合、调节失控、遗传不稳定，表达率不高。要提高转基因的效率，保证外源基因的有效表达，关键是基因构建的定点整合。转基因动物生物反应器的产品的安全性问题。这包括转基因动物的产物的分离和提纯，表达产物的结构和生物活性与人体蛋白的相似性的问题。只有从表达产物除去能引起人类变态反应的非人类蛋白，并且产品与人体蛋白有足够的相似性，才能应用于人类的健康事业。转基因动物的成活率低，出生后的部分个体表现出各种生理和免疫缺陷。如为提高生产性能而制备的转基因猪出现了雌性不育、胃溃疡和关节炎等病症； 而克隆牛已经先后死去； 转基因后获得的目的性状，通过有性繁殖后，遗传性状出现分离，如英国的一只高产1-AT 羊奶的转基因绵羊，其子代羊奶中的含仅为其母亲的1/10。尽管转基因动物生物反应器的研究仍面临着许多需要解决的问题，但它

　　潜在的社会价值是无可估量的。在未来几年内，将有多种动物乳腺生物反映器重组蛋白上市，从而形成市场前景广阔和利润巨大的新生物制药行业。