CRISPR分子诊断技术（三）

13    或许是因为LbuC2c2的特异性和非特异性剪切活性远远高于LshC2c2的相应活性, Doudna团队意识到LbuC2c2可以被用来构建高特异性、高灵敏度的RNA检测方法。若想检测出某一特定序列的RNA分子，先将与其互补的crRNA和LbuC2c2蛋白组装，再加上一些报告RNA分子。常用的一种报告RNA是一段寡核苷酸：一端附有一个荧光素（F），另一端有一个暗淬灭剂（Q）。由于猝灭作用，一个完整的报告RNA分子不会发出荧光。当LbuC2c2-crRNA抓到特定的靶RNA（activating target RNA）时，LbuC2c2的非特异性RNA水解酶的活性被激活，剪切报告RNA，其荧光素摆脱了Q的淬灭，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出靶RNA的存在。Doudna团队用这个方法成功地检测出噬菌体的RNA（右图中的l2, l3和l4），灵敏度达到0.01nM。

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14   C2c2或Cas13a系统的高度特异性取决于Cas13a-crRNA对靶RNA的识别，而高灵敏度则来自激活后的Cas13a的非特异性RNA酶活性——一个被激活的Cas13a分子可以迅速剪切大量报告RNA分子。在没有靶RNA分子的条件下，没有配对成功的Cas13a-crRNA就保持沉默，不会乱砍乱杀。CRISPR分子诊断技术的（剪切式）机理初步建立起来。

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15   这段时间张锋团队也没闲着。他们又用”钓鱼”的方法寻找新的不含Cas1的CRISPR系统。这次他们在基因库里先撒网找到CRISPR array，再把附近的基因一块儿捞上来。他们发现了Cas13b, 另一个靶向RNA的效应/干扰酶。此外，他们还发现了两个辅助蛋白：Csx27和Csx28——前者抑制Cas13b的活性，而后者则加强它的活性。Cas13b的发现为以后设计多重诊断提供了一个额外的工具。这部分结果于2017年1月发表在Molecular Cell上。

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16    仅过了3个月，张锋团队又在Science上发表了一篇里程碑式的论文，标志着CRISPR分子诊断技术的正式建立。他们在Cas13a系统的基础上，又引入了DNA常温扩增技术——RPA，创造了新的技术平台——SHERLOCK技术。待检验的核酸分子，如果是DNA，就先通过RPA扩增，如果是RNA，则通过RT-RPA扩增。扩增后的DNA产物再通过转录变成RNA分子。靶RNA的检测最后通过Cas13a-crRNA和报告RNA来完成。SHERLOCK的名字除了是这一技术的英文缩写外，还暗指传奇侦探夏洛克.福尔摩斯。用SHERLOCK检测特定的核酸分子，就好像福尔摩斯的侦探工作一样，即使是大海捞针的问题，也会迎刃而解。

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17   RPA技术是由英国科学家Niall Armes于2006年发明的。RPA和PCR功能一样，都是指数式扩增DNA分子。但与PCR不同的是，RPA技术不需要经过温度变化的周期。DNA模板双链变单链、引物结合、与延伸合成全都在重组酶、单链结合蛋白等辅助下进行。DNA扩增在一个温度（通常为体温）下即可完成。因此，RPA的一个巨大优势就是不需要特殊的设备，比如PCR仪。RPA技术也被单独应用到分子诊断领域，但因为其灵敏度不如qPCR或digital PCR（ddPCR）高，所以一直没有腾飞——直到张锋团队把它和CRISPR结合起来。

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18  许多诊断应用的灵敏度都需要达到渺摩尔（attomolar, aM或10^-18M）。有了RPA扩增这一步，SHERLOCK检测RNA（左图）或DNA（右图）的灵敏度大大增加，能够测到渺摩尔浓度的靶分子。也就是说，1微升里有一个靶DNA或RNA分子都可以检验出来（10^-18M  x  10^-6L  x  6.02 x 10²³ molecules/mole  <  1 molecule）。实现CRISPR诊断应用的最主要的一个障碍被解除了。除了增加RPA这一步，张锋团队把LshCas13a更换成LwCas13a也对提高灵敏度起到了一定作用。经过进一步摸索，SHERLOCK的所有反应都可以在一个溶液中完成，甚至能将所有试剂变成冻干粉固定在试剂纸上，也不大影响检测的灵敏度。

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