固相萃取的操作原理是将液态或溶解后的固态样品倒入活化过的SPE柱，然后利用抽空或加压使样品进入SPE柱的固定相。利用固定相和样品组分间的相互作用实现对目标组分的富集和对样品基质的去除。为提高处理效率，可以采用SPE歧管真空装置同时处理多个样品。一般地，SPE在分离步骤中保留感兴趣的组分和类似的其他组分，并尽量减少不需要测定的样品组分的保留。弱保留的样品组分可用一种溶剂冲洗掉，然后用另一较强溶剂把感兴趣的分析物从固定相上洗脱下来。有时根据样品和固定相作用强度不同，也可以让感兴趣的组分（分析物）直接通过固定相而不被保留，同时将大部分干扰物保留在固定相上，从而实现分离净化的目的。但在多数情况下，使分析物得到保留更有利于样品的净化。
SPE小柱是进行SPE处理的核心部件。一个SPE小柱由三部分组成：柱管、烧结垫、固定相，柱管一般做成注射器形状，多由血清级的聚丙烯制成，一些厂家也提供玻璃柱管。柱管下端有一突出的头，此头的尺寸已标准化，可用于各种不同的SPE歧管真空装置。烧结垫除了能固定固定相外，也能起一些过滤作用。聚乙烯是常见的烧结垫材料，对于特殊样品也可使用特氟隆或不锈钢片。固定相是SPE柱中最重要的部分最常见的SPE固定相是键合的硅胶材料，采用不规则形状、孔径60A（1A＝0.1nm，下同）、粒径40μm的硅胶粒作为原材料，然后用各种硅烷将官能团键合上。此外也有一些非硅胶基的固定相可供选用。
固定相的色谱特性决定了可被保留的组分和保留的强度，固定相的选择是发展SPE方法的最重要因素，它不仅取决于目标分析物质和样品基质，也受样品溶剂影响。
选择最佳固定相时，须考虑以下几点：
（1）目标组分在极性或非极性溶剂中的溶解度；
（2）目标组分有无可能离子化，从而决定可否使用离子交换固定相；
（3）目标组分有无可能与固定相形成共价键；
（4）杂质组分与目标组分在固定相结合点上的竞争程度。
分析物的极性与固定相极性非常相似时，可使目标组分得到最佳保留。两者极性越相似，保留越好。所以要尽量选择极性相似的固定相。例如，萃取碳氢化合物（非极性）时要采用反相柱（非极性）。而当分析物极性适中时，正、反相固定相都可使用。
固定相选择还受样品溶剂制约。样品溶剂强度相对固定相应该较弱。弱溶剂会增强分析物在固定相上的保留。如果溶剂太强，目标组分将得不到保留或保留很弱。举例来说，样品溶剂是正己烷时，用反相柱就不合适，因为正己烷是强溶剂，分析物无法在柱上保留；当样品溶剂是水时，就可以用反相柱，因为水是弱溶剂，不影响分析物的保留。
表1列出了目前常用的SPE固定相及其保留机理，以供参考。每根SPE小柱的固定相质量一般为100mg、200mg、500mg或1000mg。为保证满意的样品净化效果和充分的保留，处理脏的、复杂的或高浓度的样品时应采用固定相质量较大的小柱。
固定相 | 简称 | 主要机理 | 次要机理 | Si-OH活性 |
Ethyl（乙基） | C-2 | 非极性/极性 | —— | 阳离子交换 |
Octyl（辛基） | C-8 | 非极性 | 极性 | 阳离子交换 |
Octadecyl（十八烷基） | C-18 | 非极性 | 极性 | 阳离子交换 |
Cyclohexyl（环已烷基） | CH | 非极性 | 极性 | 阳离子交换 |
Phenyl（苯基） | pH | 非极性 | 极性 | 阳离子交换 |
Cyanopropyl（氰基） | CN | 非极性/极性 | —— | 阳离子交换 |
Diol（二醇基） | 2OH | 非极性/极性 | —— | 阳离子交换 |
Aminopropyl（氨丙基） | NH2 | 极性/阴离子 | 非极性 | 阳离子交换 |
Silica（未键合硅胶） | Si | 极性 | —— | 阳离子交换 |
Primary Secondary Amine（n丙基乙二胺） | PSA | 极性/阴离子 | 非极性 | —— |
Benzensulfonylpropyl（苯磺酰丙基） | SCX | 非极性/阳离子 | 极性 | —— |
Sulfonylpropyl（磺酰基丙基） | PRS | 阳离子交换 | 极性/非极性 | —— |
Carboxymethyl（羧甲基） | CBA | 阳离子交换 | 极性/非极性 | —— |
Diethylaminopropyl1（二乙基胺丙基） | DEA | 极性/阴离子 | 非极性 | 阳离子交换 |
TrimethylaminopropyI（三甲基胺丙基） | SAX | 阴离子交换 | 极性/非极性 | 阳离子交换 |
表1 常用的SPE固定相极其保留机理
而对于体积较大的液相样品，如水样分析，还可用储样器，连接在柱管上方以增加sPE容积，能在很大程度上提高一次上样量（可达75～100mL）。
SPE方法一般有四个基本操作步骤:固定相活化、样品上柱、淋洗和分析物洗脱。活化的目的是创造一个与样品溶剂相容的环境并除去柱内所有杂质。上样步骤指的是样品加入到SPE柱并迫使样品溶剂通过固定相的过程这时分析物和一些样品干扰物保留在固定相上。
为了保留分析物，溶解样品的溶剂必须较弱。分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的样品组分。淋洗溶剂总是略强于或等于上样溶剂。淋洗溶剂必须尽量地强以洗掉尽量多的不需要的组分，但不能强到可以洗脱任何一个分析物的程度。淋洗过后，将分析物从固定相上洗脱。洗脱溶剂用量一般是0.5～0.8mL/100mg固定相。这时必须认真选择溶剂：溶剂太强，一些更强保留的不必要组分将被洗出来；溶剂太弱，就需要更多的洗脱液来洗出分析物，SPE柱的浓缩功效就被削弱了。表2中列举了SPE方法中常用的溶剂以及它们的洗脱强度，以供参考。收集起来的洗脱液可以直接向色谱柱进样，也可以把它浓缩后溶于另一溶剂中来进样或以其他方式进行进一步净化。
正相 | 反相 | |
己烷 | 弱 ↓ 强 | 水 |
异辛烷 | 甲醇 | |
甲苯 | 异丙醇 | |
氯仿 | 乙腈 | |
二氯甲烷 | 丙酮 | |
四氢呋喃 | 乙酸 | |
乙醚 | 乙醚 | |
乙酸 | 四氢呋喃 | |
丙酮 | 二氯甲烷 | |
乙腈 | 氯仿 | |
异丙醇 | 甲苯 | |
甲醇 | 异辛烷 | |
己烷 |
表2溶剂强度列表
因为方法步骤较多，且影响萃取结果的因素也较多，发展一个成熟的SPE方法必须进行参数优化。优化过程中必须考虑的因素包括固定相的选择，洗脱溶剂的选择，柱容量，以及洗脱流速等。一个好的SPE方法能对特定的复杂基质中多个目标组分同时实现可靠的定量回收并有一定的稳健性，适合在不同实验室间进行推广。
经过十几年的快速发展，SPE方法的商品化程度相对较高，有多种适用于不同样品基质不同目标组分的SPE小柱以供选择，且价格较低。虽然SPE小柱不能反复使用，总体来说，样品预处理方法的成本仍可以接受。对于典型应用领域，已经发展出一些标准化方法，省却了用户自行发展SPE方法的步骤。一些应用实例请见参考文献。读者也可根据具体需求查阅文献、技术说明和应用报告，获取更多方法细节。
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