四氧化锇虽然具有以上优点，但它也存在不少缺点：
四氧化锇渗透力弱，所以组织块要小。否则，将从组织块表面到中间形成一个固定梯度，致使内部自溶过程继续进行引起组织块内部固定不好。
不能保存糖原也不能有效固定核酸，而且对微管固定效果也不理想。
固定的时间不宜太长。时间过长，会使组织变脆，给切片带来困难。此外四氧化锇与蛋白质、不饱和脂肪酸交联形成的复合体都是易溶于水的物质，特别是在长时间的固定后，更易溶解。因此，使用四氧化锇固定样品，时间控制在12小时较为适宜。
四氧化锇能与乙醇或醛类起氧化－还原反应，生成沉淀。所以，醛类处理过的样品转入四氧化锇固定之前或四氧化锇固定之后转入乙醇溶液脱水之前都必须用相应的缓冲液充分漂洗干净。
四氧化锇是酶的钝化剂，不能用于细胞化学的研究。
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