肉毒中毒的实验室诊断，从病人的血清、粪便、呕吐物及可疑食品等样本中检测到毒素是最可靠的诊断依据。在美便、胃肠道物和受伤组织等样本中检测或分离到肉毒杆菌，可支持诊断，但不能以此确诊。但在一些婴儿肉毒中毒病例中，只要在粪便或胃肠物中发现肉毒杆菌，即使在样本中检测不到肉毒毒素，也有确诊意义。
小鼠生物试验（致死试验）是国际公认的肉毒毒素检测金标准方法，也是最灵敏的检测方法，灵敏度可达1MLD（相当于10pg）.双抗夹心ELISA是美国SDA和AOACinternational批准的第一个官方认可的肉毒毒素检测方法，灵敏度可达100pg.在我国针对食品微生物检验制定了肉毒杆菌与肉毒毒素的国标GB/T4789.12-2003。该标准主要包括：检测毒素的小鼠致死试验以及菌落形态观察试验、产毒培养试验和分离培养试验等。现行标准的缺点是耗费时间长、需使用实验动物和各型别肉毒毒素的诊断血清。
肉毒毒素的检测方法还包括：禽眼睑闭合试验、快速免疫层析试验、肽链内切酶ELISA等。禽眼睑闭合试验是我国学者建立的一种新的生物试验法，灵敏度可达1ng。基于金标记的免疫层析法可在5min内出结果，操作简单，但灵敏度低（10~50ng），适合现场快速筛查。基于肽链内切酶ELISA是利用肉毒毒素的内肽酶活性，结合免疫学检测方法或光谱技术检测裂解的底物多肽，或者在底物蛋白上作荧光标记，裂解后检测荧光信号。该方法最大特点是能检测有活性的毒素，且特异性强、灵敏度高，也可用于毒素分型检测，值得推广使用。
肉毒杆菌的核酸检测方法已非常成熟，如PCR、荧光定量PCR以及多重PCR等检测A~F型肉毒杆菌的试验方法均有报道。但还没有肉毒杆菌核酸检测的国家标准，仅有A、B、E、F型肉毒杆菌PCR检测的行业标准（SNT2525-2010）。有必要尽快制定A~G型肉毒杆菌的PCR或荧光定量PCR检测的国家标准，以满足食品生产企业的需求。
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