构建重组基因载体
绝大多数的基因敲除策略都是基于同源重组的机制，其基因载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是影响同源重组效率的关键因素。
用电穿孔显微注射方法
把重组DNA转入受体细胞（一般是胚胎干细胞）核内。
同源重组
基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，实现载体DNA同源目的序列与染色体靶位点的同源重组。
筛选
用选择培养基筛选已击中的细胞。
表现型研究研究
将击中细胞转移入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
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