（1）制片技术：肌肉的组织化学染色主要是测定肌肉中各种酶的含量，由于石蜡切片的处理过程中常将肌肉中的酶破坏，故已被淘汰。主要用液氮快速冷冻法。
首先将肌肉标本纵向垂直种植在一小软木片上，放置时应注意肌纤维的方向，周围用黄耆胶固定，露出肌肉上端。然后将盛有异戊烷的烧杯放入液氮容器（保温瓶）中，当烧杯底部异戊烷形成白色粘稠状时，表明温度已降至－160℃，用长镊夹住肌肉标本浸入异戊烷快速冷冻，此过程约10～20秒。冷冻后将肌肉标本置于超低温冰箱储存。
冰冻过程是肌肉活检的关键步骤，肌肉组织中水分含量高，制片过程中易出现冰晶，给诊断造成困难。异戊烷间接制冷则可以防止液氮在肌肉表面形成气泡影响制冷速度，避免在肌纤维内形成冰晶伪差。如异戊烷短缺也可直接投入液氮中。
在恒冷箱式冰冻切片机（－20℃）条件下切片，厚度8～10μm左右，免疫组化为5μm。
（2）染色方法：组织化学技术是在组织切片上通过分解、置换、氧化、还原等化学变化，经呈色反应显示组织细胞内的化学成分，对肌纤维的代谢产物和酶活性进行定位。染色方法很多，一般根据临床及HE的结果而增加。常规应包括HE染色、Gomori染色、还原型辅酶Ⅰ四氮唑还原酶（NADH-TR）染色、PAS染色、苏丹黑或油红O染色及ATP酶染色等。
①HE染色：HE（haematoxylin-eosin，HE苏木素-伊红）染色在组织学上是一种应用最广泛的染色方法，通过HE染色可清楚地观察到各种不同的组织结构，并为其他染色提供佐证。正常细胞核染成淡蓝色，细胞浆染成红色。
②Gomori三色染色：此染色主要用来检测横纹肌肌浆内的线粒体，当线粒体肌病患者的横纹肌肌浆内有大量线粒体异常堆积，异常线粒体多聚集在肌膜下，经Gomori三色染色被染成红色称“破碎红纤维”（ragged-red fiber，RRF）。肌原纤维呈暗绿色，结缔组织亮绿色，肌核紫红色，肌膜和线粒体呈红色。
③PAS染色：PAS（periodic-acid schiff stain，PAS）染色原理是肌糖原经过碘酸氧化，使1，2二醇基形成双醛，再与Schiff试剂作用生成紫红色沉淀。主要用来诊断糖原累积病。值得注意的是本反应无特异性，除肌糖原外，其他多糖、中性粘多糖、糖蛋白、糖脂等均可呈阳性反应。因此，染色时应有对照。
正常细胞核呈蓝色，肌原纤维间的肌质网呈红色或紫红色，Ⅱ型纤维深于Ⅰ型纤维。
④油红O与苏丹黑染色：油红O与苏丹黑均为脂溶性染料，溶于有机溶剂中制成饱和溶液，当组织切片置于其内时，染料分子进入细胞内使组织中脂类着色。苏丹黑与大多数脂类结合，油红O易与甘油三酯结合。
油红染色肌质网内有橙红色脂滴，细胞核染成蓝色，Ⅰ型纤维脂滴多，Ⅱ型纤维脂滴少。苏丹黑染色肌质网内有黑色脂滴，核染成红色，Ⅰ型纤维深于Ⅱ型纤维。
⑤非特异酯酶染色：非特异酯酶（non-specific eslerase，NSE）主要定位在内质网、溶酶体，利用α-醋酸萘酯为底物，经偶联反应形成棕红色沉淀，酶活性的部位显示棕红色，可显示运动终板的病变。用于重症肌无力等疾病的诊断。
酶活性部位呈棕红色，Ⅰ型纤维重于Ⅱ型纤维。
⑥ATP酶（三磷酸腺苷酶）染色：ATP酶染色为重要的染色，可用于区分肌纤维类型。ATP酶与肌球蛋白分子结合并受钙离子所调节。染色时ATP酶先被钙离子激活，再经氯化钴置换钙离子，形成硫化钴黑色沉淀，有ATP酶活性的肌纤维被染成黑色。
将肌组织切片事先在不同氢离子浓度的液体内孵育，可以抑制某一型肌纤维的ATP酶活性。如碱性环境中抑制Ⅰ肌纤维ATP酶活性，因此经碱性孵育液孵育，Ⅱ型纤维着色深，Ⅰ型纤维无色。而酸性环境抑制Ⅱ型肌纤维的ATP酶活性，经酸性孵育液孵育后，Ⅰ型纤维着色最深，Ⅱ型纤维无色，要求孵育液的pH值一定要测量准确，相差0.1即影响结果（表1）。
⑦NADH-TR染色：NADH-TR（还原型辅酶Ⅰ四氮唑还原酶，NADH-tetrazolium raductase）为有氧代谢电子传递链中的一个酶，定位于线粒体和肌质网。反映三羧酸循环细胞色素系统和其他氧化代谢途径的利用情况。本染色原理以NADH为底物，无色的四唑盐作为受电子体并被还原成蓝紫色的不溶性甲quan，甲quan沉淀于酶活性部位。本染色反映的是三羧酸循环细胞色素系统和其他氧化代谢途径的情况。
肌质网和线粒体染成蓝紫色，肌原纤维无色，Ⅰ型纤维着色深于Ⅱ型纤维，Ⅰ型纤维染成蓝紫色，Ⅱ型纤维染成淡灰色。本染色的优点是能显示肌原纤维的内部结构。
⑧酸性磷酸酶染色：酸性磷酸酶（ACP）主要定位于溶酶体内，内质网和胞浆内也可见有其活性，本染色以萘酚AS-BI磷酸酯为底物，经酶水解释放出萘酚AS-BI，然后与重氮盐偶联形成红色产物。
酶活性部位呈红色，核呈绿色，正常肌纤维此酶阴性，炎性或退变等病理性肌纤维呈阳性。可证明炎性细胞、坏死肌纤维酸性麦芽糖酶缺陷。
⑨磷酸化酶染色：磷酸化酶（phosphoryl，PPL）为糖原酵解的限速酶，主要位于内质网上，可将糖原分子中葡糖基1.4键断裂。染色原理是以G-1-P为底物，使其合成糖原，然后以Lugol碘液显色，6个葡糖基以下不显色，8～12个葡糖基直链显红色，30～50个葡糖基显蓝色。为糖原累积病（McArdle）的特异性诊断。
酶活性部位呈灰至蓝色，Ⅰ型纤维呈灰色，Ⅱ型纤维呈棕蓝色，正常Ⅱ型纤维着色强于Ⅰ型纤维，如呈浅黄色为阴性，但一定要对照，及时观察。
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