2．检测：（PCR方法）
取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：
各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上
待 PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder
半小时后照相，观察胶图：insert、vector、阴性三个样品除了有少量引物带（大约在200bp左右）外，均无其他带形。阳性带形清晰。好的连接产物应在500
至 4、5Kb大小之内形成一条清晰的smear。
六．电转化流程
1.电转化感受态细胞的制备
1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）
2.37℃，220rpm，培养 14-16个小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。
5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl 感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
9.次日观察转化子生长情况，并记录。
2.连接产物纯化
1.将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:
10ul of ddH2O
2ul of 3M NaAC（PH5.2）
50ul of 无水乙醇
轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；
2.4℃，top Speed 离心30分钟；
3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；
4.加入 500ul 70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；
5.4℃，top Speed离心5分钟；
6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；
7.加入10ul ddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；
3.电转化
1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；
2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。
4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；
6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
7.37℃，220－250rpm复苏1小时。
8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。
注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。
4. 电击杯清洗流程
1.用清水将电击杯稍冲一下。
2.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4.加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。
5. 弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。
6.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。
注：1.不同样品使用的电机杯应分开；
2. 每周用1％酒精浸泡30分钟。
七.快速鉴定、菌落PCR
1.质粒快速鉴定
试剂：
Protoplasting buffer:
步骤：
1．将转化后的菌液铺平板，37℃过夜培养。
2．配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶。
3．用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 µl Photoplasting Buffer。
4．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer 的96孔板中，振荡混匀。
5．用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中，每孔4 µl，用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中（细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min），并点上Marker。
6．调节电压为20V（小槽）或40V（大槽），电泳15min，使细胞充分裂解，将电压调高到200V，继续电泳1hr，照相。
7．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
2．菌落PCR
1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入 17.3ul的灭菌水。
2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。
3．依次加入：
各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上
4.94℃，2min。
6. 待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
7.将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。
八.pBlueScript cDNA库扩增
1．试剂及配方：
2 x LB （1 升）：
20g 氯化钠
20g 蛋白提取物
10g 酵母提取物
加入蒸馏水至1升，用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌
2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）
175ml 2 x LB 液体
25ml 甘油（100％）
加入蒸馏水至200ml，压灭菌，置于4℃备用
2．步骤
1．将cDNA文库转入大肠杆菌，如DH5a(DH10B)后，取少量菌液涂布氨苄平板，以推算克隆总量。
2．取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体，每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆，可以适当增加2 x LB液体的量，但不能少于此比例
3．按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入 SeaPrep agarose
4．70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟.
5．37℃放置1小时
6．加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml
7．加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡
8．将三角瓶置于冰水中1小时,水面必须没过三角瓶内液面
9．轻轻取出三角瓶,30℃培养40-45小时
10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心 10,000g ,20分钟,必须室温
11.弃上清,每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB－甘油（12.5%）重悬.
12. 将重悬液留下10ul检测滴度,其余分装于1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存
13.取1ul扩增后菌液倍比稀释.
14.各取 10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数.
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