4EcoRIadaptor加接:
1.往双链 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mMrATP
1ul T4DNA Ligase(4U/ul)
3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:
1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活 T4DNALigase;
2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×LigaseBuffer
1ul 10mMrATP
6ul ddH2O
1ul T4PNK(10U/ul)
3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4.稍微离心使反应物集中至管底;
5.室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul XhoI(10U/ul)
6.37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7.反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit回收试剂盒)
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ulEB/300ml胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分别放入已做标记的 1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积bufferQXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEXII使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEXII保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入 500ul bufferQXI，轻弹管底使QIAEXII重悬
10．离心并去上清（同操作8）
11．加入500ul bufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，去上清
12．再加入500ul bufferPE，重悬QIAEXII，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13．超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEXII，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14．取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15．将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1％的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。
四．载体制备
1．pBlueScriptII 的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB 平板上，37℃培养过夜。
2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。
3．第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。
4．将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心 15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）
5．加入10ml溶液Ⅰ （50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至终浓度100µg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。
6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置 3-5min。
注： 静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。
7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。
8．4℃，5000rpm，离心15min。
9．取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。
10．每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。
11. 20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。
12．弃上清，用70％的乙醇洗2次。
13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。
14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。
15．电泳检查DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切
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