cDNA文库组标准流程-2

(二)动物组织totalRNA的提取
1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。
2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。
3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。
4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
5．冰浴10分钟。
6．4℃，12000g离心20分钟。
7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8．加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀 30分钟以上。
9．4℃，12000g离心20分钟。
10．根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11．加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
12．4℃，12000g离心20分钟。
13．小心转移上层水相于另一个 RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀至少30分钟。
14．4℃，12000g离心20分钟。
15．弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4℃，12000g离心10分钟。
16．弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17．取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

表1

(三)植物组织totalRNA的提取 1.先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。
3.加入 0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。
4.加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。
5.冰浴10min。4℃，12000g离心10min
6.小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。
7.4℃，12000g离心20min。
8.去上清，取沉淀。加1ml4M的LiCl溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。
9.4℃，13000rpm离心 15min。
10.用0.4mlDEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。
11.4℃，13000rpm 离心10min。
12.取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。
13.4℃，13000rpm 离心15min。
14.弃上清，用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。
15.弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。
16.用40－60ulDEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。
17.取少量RNA 用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

(四).TRIzolReagent提取 totalRNA(GIBCO)
1．查表2根据样品量选择适当的TRIzolReagent体积装入50mlRNase- free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzolReagent体积的10%。
2．将组织样品放入TRIzolReagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。
3．室温温育10分钟。
4．据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。
5．4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。
6．转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。
7．4ºC,12000g 离心10分钟。
8．去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9．4ºC，7500g离心5分钟。
10．去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置 -80ºC冰箱中保存