三．cDNA双链合成
1.SupersciptII —RT合成第一链:
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)
(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-xulRNase-freewater
（大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2.混匀后,70℃反应10分钟;
3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×firststrandbuffer
2ul 0.1MDTT
1ul 10mMdNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6.反应完成,趁热加入1ulSupersciptII—RT,混匀;
7.42℃反应 50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2.cDNA第二链的合成:
1.第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNAPolymeraseIbuffer
6ul 10mMdNTP(自己配制)
xul ddH2O
1ul RNaseH(2U/ul)
10ul DNAPolymeraseI(10U/ul)
总体系为200ul;
2.混匀后,16℃反应2.5小时;
3.70℃灭活10分钟;
4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3.双链cDNA末端补平:
1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mMdNTP
2ul T4DNAPolymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30 分钟,然后75℃灭活10分钟;
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5.吸取上清至另一 eppendof管,加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下 13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。
PCR 纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB，混匀。
3．加入spincolumn中，13000rpm离心1min。
4．加入 0.75mlbufferPE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spincolumn 放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入 30ulbufferEB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
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