二.mRNA的分离
1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法
准备工作：
1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置于室温。
2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。
3.将 OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。
试验步骤：
表3：加入试剂量据此表
Total RNA | RNase-free Water to: | Buffer OBB(ul) | Oligotex | Prep size |
<=0.25mg | 250ul | 250ul | 15 | Mini |
0.25-0.5mg | 500ul | 500ul | 30 | Midi |
0.5-0.75mg | 500ul | 500ul | 45 | Midi |
0.75-1.00mg | 500ul | 500ul | 55 | Midi |
1.TotalRNA量不要多于1mg ，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-freewater补足到500ul
2. 根据表3加入适当体积的OBBBuffer和OligotexSuspension，轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3.置于70℃水浴中 3min
4.取出置于室温（20℃－30℃）10min
5.13000rpm室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。
6.用移液器取400ulOW2Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到SpinColumn 中，RT，13000rpm，离心1min
7.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml离心管中，加 400ulOW2，RT，13000rpm，离心1min
8.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml管中，取出 25ulOERBuffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。
9.取出 25ulOERBuffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。
10.测OD,并电泳定量。
2.磁珠法分离mRNA
1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg 的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2.65ºC加热10分钟。
3.加入3ul生物素标记的 Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。
4.同时配 0.5×SSC1.2ml和0.1×SSC1.4ml.
5.将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。
6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。
7.将（3）中的 oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10分钟。
8.用磁性分离架捕获SA- PMPs,小心去上清，但不要弃去。
9.用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.
10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1mlRNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。
11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。
12.将SA- PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。
13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若 mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。
14.加0.1体积的3mol/lNaAc和 1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀过夜。
15.4ºC，13000g离心60分钟。去上清，加入500ul70%乙醇混匀。
16.4ºC，7500g 离心10分钟。
17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。
18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项：
1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行
2．如果totalRNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。
3．mRNA的电泳图是smear.
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