色谱分离过程受到诸多因素的影响，其中包括液相色谱系统及其特征参数，色谱系统本身对分离的影响在分析方法的转移转换时显得尤其明显。因此，了解并掌握色谱系统以及系统间的差异，有助于我们运用策略来提高方法转移转换的成功率。
跨仪器平台的分析方法转移转换受两个特征参数的影响，它们对色谱分离的影响各不相同。
本文将重点介绍系统延迟体积对方法转移转换的影响，并总结能够消除这些影响的具体策略。
运行0～100% B 的梯度(流动相B中含有紫外吸收化合物，在本例中为咖啡因)，并使用紫外检测器记录紫外吸收剂响应随时间的变化情况，该记录即可反映梯度输送的延迟。
图1. 系统延迟体积的测定方法。流动相B中含有紫外吸收化合物，梯度程序为0~100% B。上图所示为梯度程序(黑色)与紫外信号(红色)的叠加谱图。计算方法如下：首先确定紫外谱图中吸光度达到50%最大吸光度的时间(t½)，然后减去设定梯度程序时间的½，即得到延迟时间(tD)，最后将该值乘以流速(F)换算为体积。条件：流动相A：水；流动相B：10 mg/L咖啡因水溶液；波长：273 nm。所有系统均配备限流器，以确保在系统的推荐操作压力范围内执行测定。
UPLC、UHPLC和HPLC四元及二元系统的延迟体积从＜100 nL到超过1 mL不等，各系统的延迟体积取决于泵的设计。
在四元泵中，梯度混合在梯度比例阀(GPV)处进行。在混合器、管路以及比例阀均相同的条件下，该阀 (通常位于混合器之前)造成的延迟体积通常比二元系统的延迟体积更大，原因是GPV位于泵压缩溶剂的位置之前。总延迟体积不仅包括比例阀和混合器的体积，还包括泵头本身的内部体积。
在二元系统中，混合器在泵压缩溶剂之后进行梯度混合；且不存在会影响延迟体积的梯度比例阀，而是通过改变泵A和泵B的流速来形成梯度，从而提供所需的流速和溶剂组成。
转换梯度方法时，系统的延迟体积会影响梯度分离的保留时间和色谱分离的选择性。因此，在进行分析方法的转移转换时有必要对分析方法进行一定的调整，以消除系统间延迟体积差异带来的影响。调整方法包括：调整相对于进样的梯度开始时间和修改梯度表。
方法转移时，调整相对于进样的梯度开始时间的方法:
方法转换时，调整相对于进样的梯度开始时间可使用方法转换计算器计算得出:
为了说明系统延迟体积的影响，我们以某中药的UPLC方法转移为例，展示不同系统延迟体积对分离结果的影响。
色谱条件
仪器系统：ACQUITY UPLC H-Class系统+TUValu检测器
色谱柱：CORTECS T3，2.1×100 mm，1.6 μm
流速：0.25 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：350 nm；进样量：1 μL
流动相A：乙腈；流动相B：磷酸水溶液，梯度洗脱
1、相对于进样的梯度开始时间：进样中
2、相对与进样的梯度开始时间：进样后100 μL
3、相对与进样的梯度开始时间：进样后200 μL
另外一种消除系统延迟体积对分离结果影响的方法是调节梯度表，然而，由于该方法需要修改原始梯度表，因此在受监管的环境下可能需要对方法进行重新验证。
梯度表延迟0.4 min :
原始梯度值
调整后的梯度值
梯度表延迟0.8 min :
原始梯度值
调整后的梯度值
总结
在进行系统间方法转换和转移时，应考虑不同系统延迟体积差异的影响
可通过调节梯度开始时间点，或者增加/减少梯度起始阶段时间长度来消除不同系统延迟体积对梯度分离带来的影响
虽然调节梯度起始时间段长度可以消除不同系统延迟体积对分离的影响，但该方法需要修改梯度表，在严格的法规监管环境下需要重新对方法进行验证
USP(621)允许对系统延迟体积差异进行调整，Empower严格的法规依从性，允许用户在软件方法中进行调整，消除系统延迟体积的影响；这也是Empower软件区别于其他软件的优势
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