色谱分析小技巧 | 如何排查色谱柱柱压高、鬼峰及重现性问题

在液相分析中，各种各样的问题都会影响最后的分析结果。从色谱柱的使用角度来说，柱压高、出现鬼峰，以及新柱不能重现旧色谱柱谱图的现象被公认为是经常困扰实验员的三大问题。

作为《色谱分析小技巧》系列第二期专题，今天小编将主要围绕这三大问题，具体讲解并给出对应的排查建议。

首先需要确认压力是突然升高还是逐渐升高。

Case I：突然升高

此种情况下请确认样品是否澄清，同时通过分段依次检查的方法排查压力升高位置：系统压力、在线过滤器（如果有）、保护柱（如果有）。

Case II：逐渐升高

此种情况下需要注意：

• 样品制备时是否要加强过滤或离心（注意滤膜的材质及品质）；

• 需要好好清洗色谱柱，同时加强分析过程中的柱清洗，如不含盐的梯度洗脱终点提高有机相的比例保持一段时间，或者在进样序列中加入清洗梯度。

此种情况下需特别注意：

• 流动相配制时是否需要加强过滤；

• 水相流动相是否长期放置，容易长菌（特别是在天气较热时，磷酸盐缓冲液及纯水相易长菌，建议当天新鲜配制，且连瓶更换）；

• 有机相的品质须保证，建议使用高品质有机相；

• 检查系统背压，特别是水相通道的压力，如果压力明显偏高，提示有长菌污染，需对系统进行彻底清洗。

不明峰的出现，排除样品降解或柱上残留后，最有可能来自于以下几个方面：

• 原因：最常用的隔垫材质是双层，上层硅胶、下层（面向样品）PTFE；样品穿刺取样后在隔垫层中的样品残留，难以通过清洗彻底除去；PTFE惰性强，但柔韧性不如硅胶：钝针头穿刺、和/或重复清洗，PTFE层容易开裂，暴露硅胶层，硅胶层接触样品溶液，释放污染物。

• 建议：使用预装好的盖垫，避免自装时装反；一次性使用盖垫，避免清洗不干净带来交叉污染。

• 排查方法如下：

• 建议：使用高品质的有机溶剂、缓冲盐及添加剂。

• 原因：不同材质滤膜的溶剂耐受性不同，若选用溶剂耐受性不合适的滤膜过滤溶剂和样品，都有可能从滤膜上溶出额外的物质，从而带来“鬼峰”。

• 建议：选择兼容性较好的有品质的过滤器及滤膜，如GHP材质能够完美兼容水/酸/碱/极性有机溶剂/非极性有机溶剂。

在分析时经常会遇到新柱不能重现旧色谱柱谱图的现象，可以从以下几方面排查：

• 对于使用缓冲盐体系的色谱条件，充分地活化平衡对于保证分析结果的稳定性至关重要；在蛋白等大分子分析中，老化也是保证分析结果稳定的要素之一。

• 色谱柱中的填料可以被离子对试剂化学性地改变，变化程度取决于填料被使用和处理的状况。

• 对于酸/碱性化合物来讲，分析物pka±2以外的pH值保证是其在反相分析条件下的稳定保留，是保证其分析方法的稳定性和耐受性的重要因素。

• 排查方法：如手头有可用的旧柱，请对同一个样品、同一系统、同一配制流动相进行平行对比，建议每根色谱柱上重复3次平行进样；如果两根色谱柱上的各自3针进样谱图均稳定重现，而两根色谱柱的谱图有所差异（个别峰的增加/丢失/分离改变），可确认两柱有差异，可能该项目条件敏感，导致对色谱柱批次敏感（挑批次）。

• 建议：如有可能，建议优化方法；或者在方法建立时，用至少两根以上不同填料批次的色谱柱进行方法重现性检查。

以上就是小编对三大色谱柱常见问题的故障排查心得，希望能帮您解决分析中的问题！

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