对于反相制备色谱而言，我们通常可以通过多种策略改进分离效果，比如：色谱柱长度，填料粒径，键和官能团种类等，对于填料粒径以及键合的官能团的改变来说，柱效的改变是比较明显的，而色谱柱长度的改变对于多肽分离效果的影响是否明显，我们尚无数据支持，此次将会进行相关尝试，我们希望可以和大家分享一下我们尝试的结果。
在保持固定相官能团、填料粒径不变的情况下，色谱柱长度增加则理论塔板数相应增加，样品和固定相之间的相互作用会更加充分，最终分离度和产品纯度都会得到相应提升，以上推论在很多制备HPLC案例中都有充分体现。由于有相同的理论依据，我们推测多肽样品的Flash纯化也同样适用，下面将通过实验进行摸索。
首先我们用Alstra多肽合成系统合成了一个具有18个氨基酸残基的双性多肽分子作为实验样品，此次合成的总产率为69.4%，下图为此次粗品HPLC分析谱图，由图所知副产物以及相关杂质和主峰之间具有一定的分离度，说明该样品较为适合此次实验。
Figure 1：18A多肽粗品分析谱图。
美中不足的是，此样品为油状物，需要将其溶解到DMSO中再进行上样分离，在Biotage Isolera Dalton2000的帮助下，我们将溶解后的100ul样品进行分离尝试实验，色谱柱型号：10g SNAP Bio C18。所得纯化谱图如下：
Figure 2: 18A多肽粗品Isolera系统下分离纯化谱图
初次的Flash分离尝试比较顺利，特别是在样品量较小时，可以很容易鉴别出主峰，从质谱峰也清楚发现样品的三个质谱峰：m+2 (1101), m+3 (734.4),和 m+4 (551)。我们使用V10将馏分11-13合并，同时进行了HPLC纯度分析，结果显示纯度在95%以上！SNAP Bio 的分离很出色。
Figure 3: 18A多肽粗品Isolera系统下，通过SNAP Bio色谱柱纯化后分析谱图
接着我们将两个完全一样的SNAP Bio 10g色谱柱连在一起进行分离尝试，可能大家对于这样的连接产生疑问：固定相填料之间被切断、流动相的横切面也被相应的缩小和放大，这在一定程度上可能会影响色谱分离的效果，进而使得柱长的增加效应不显著。但是Biotage SNAP Bio色谱柱拥有非常完美的进样分配系统，能够让这种效应对实验的影响降低到最小。
Figure 4: 两根SNAP Bio C18 10g色谱柱连在一起来增加柱长。
第二次增加柱长后的实验中，我们使用了相同的梯度方法、相同的流速以及相同的样品量。
Figure 5: 18A多肽粗品使用两根SNAP Bio 色谱柱分离纯化谱图
分离谱图令人出乎意料：增加了一根色谱柱之后，随后背压也增加了一倍，这属于正常现象。通常情况下，被压的增加可以使得色谱峰型更加紧凑，然而这种情形并没有出现在此次实验中。我们想到色谱柱的增长可能会使得峰型变宽，但并没有考虑到会如上图所示，几乎丧失了峰值，而且目标离子峰的噪音非常大。即便如此我们仍旧将馏分9-15收集在一起，使用V10将溶剂旋干后，进行HPLC纯度分析。
Figure 6: 18A多肽粗品Isolera系统下，通过两根SNAP Bio色谱柱纯化后的分析谱图
分析之后发现，收集到的馏分即为目标分子，此次纯化后的纯度仍然在95%以上，说明第二次的实验仍是成功的。可以发现，在没有质谱监测器的帮助下，仅仅通过紫外吸收来鉴别目标分子峰几乎是不可能的。
基于以上两次初步实验结果对比，我们将更倾向于只用一根色谱柱进行分离，关于色谱柱长度的测试对比，仍然还有非常多的实验值得去探索：比如使用相同内径不同长度的色谱柱进行对比；我们将会在以后的文章中进行分析和讨论。
关于此次色谱柱长度对多肽分离的影响，您是否也有过相关经验和见解？欢迎和我们联系！
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