今天
小编向大家介绍Jacco van Rheenen教授使用LEICA TCS SP8 DIVE新型光谱可调式多光子共聚焦解决小鼠活体深度成像中的实际问题。
图1. Jacco van Rheenen教授
van Rheenen教授目前就职于荷兰皇家艺术与科学研究院下属乌得勒支Hubrecht研究所，其团队主要研究方向包括发育生物学、干细胞和癌症研究。在他的研究工作中，对活体动物乳腺肿瘤细胞转移的可视化一直是重要的研究手段，因此十分熟悉各种成像技术，如双光子显微镜、活体FRET成像等。
图2. Confetti小鼠小肠，灰色：胶原蛋白，绿色：干细胞，蓝、红、黄色为多种分化子代细胞。van Rheenen教授提供。
Q
在对confetti小鼠进行成像时，您面临哪些挑战？
van Rheenen 教授：confetti小鼠活体成像有三个主要挑战。
首先，最具挑战性的是在小鼠组织更深处成像的同时仍然获得高对比度的图像。为了获得很好的对比度，我们希望能检测到每个信号光子，但不幸的是，大量信号会在组织中散失。
另一个挑战是动物活体成像总会遇到呼吸引起的图像扭曲问题。避免这些扭曲的一种方法是非常快速地对组织成像。然而，这也会导致收集到的有效信号减少以及图像对比度的下降。
最后一个主要挑战是多种荧光信号区分。为此，可以在动物模型中设计多种独立波长激发荧光标记，但是这导致成像采集时间显著变慢、并因此导致潜在的成像失真。为了避免这种情况，我们使用一种激发光同时激发所有荧光团，并且在这种情况下，发射光光谱应该不同。不幸的是，confetti荧光团的发射光谱广泛地重叠。传统的二向色镜一直都不是区分多种荧光团的最佳选择，但是对于SP8 DIVE中使用的4Tune NDD光谱检测器，这将变的很容易，因为我们可以真正优化想要检测的每个荧光团的波长（图3）。
图3. 4Tune催生了新的染料组合：Confetti 小鼠小肠。细胞谱系示踪剂。青色：CFP ；绿色：GFP ；黄色：YFP ；红色：RFP，结肠癌研究。van Rheenen教授提供。
Q
使用传统多光子共聚焦对这些样品进行成像会遇到怎样的困难？
van Rheenen 教授：我们的confetti小鼠样本中的细胞可以同时表达CFP、GFP、YFP或RFP，并且还想快速对它们成像。传统多光子系统会存在严重的问题：首先，所有这些染料都不能用单一波长进行最佳激发。你可以使用不同波长的连续成像，但这会使采集时间加倍，进而使呼吸运动引起的图像失真倍增。此外，由于不同激发波长的色差，在同一Z轴焦平面获取不同的confetti图像十分困难，当然，这也会导致假象。
图4. 4Tune NDD检测器 vs 传统滤片。
Q
光谱可调式4Tune NDD检测器对未来样品检测的最大优势是什么？
van Rheenen 教授：随着新型探针的不断出现，对每个探针单独优化激发和发射光谱的需求必将越来越大。特别是对于发射光谱来说，它很繁琐：你可以设置一个或两个滤片，但不是很便捷。如果你的样本中不只一个荧光团，比如2或3个，你必须小心翼翼地优化系统才有可能成像。传统单光子或多光子系统都是使用滤片的检测方式，但是系统硬件中可供安装的滤片位置数量有限，在真正使用过程中，必然会受到很大的限制（图4）。使用LEICA SP8 DIVE中的4Tune NDD光谱式检测器，你只需在软件中拖动按钮即可自由优化每个荧光团的检测（图5）。对于深组织的成像，准确地优化检测波长对最大程度地捕捉从荧光团中发射出来的信号光子很关键。此外，我们经常会拼接多视野数百个Z层图像，以便获得高分辨率的大面积组织成像，如果各个荧光通道独立分别成像，花费的时间不可想象！通过4Tune NDD优化检测波长，我们可以同时成像多个荧光团，节省大量时间和工作量！
图5. 4Tune NDD检测器与HyD混合成像检测器结合，实现光谱的自由可调。
Q
之前研究中碰到的问题现在得到解决了吗？
van Rheenen 教授：是的，传统的二向色性不能区分像YFP荧光和自发荧光。通过SP8 DIVE，我们现在可以获得真正的发射光谱，从而真正分离出我们之前无能为力的高度重叠的荧光团。
视频1. 白、红、绿和蓝色标记Confetti小鼠心肌细胞系，van Rheenen教授提供。
Q
您认为SP8 DIVE光谱自由可调式检测活体小鼠内荧光的应用前景如何？
van Rheenen 教授：对于许多复杂的活体生命科学研究，花数小时、几天、几周甚至几个月进行细胞变化的可视化当然非常重要的。但问题在于，在许多组织中，细胞的位置、甚至是细胞的组成种类，随着时间的推移，都会发生显着变化。因此，长时间对同一组织中的细胞成像是会给实验带来很大不确定性。
这些confetti小鼠绝对是独一无二的，因为你可以非常零星地标记单个细胞。因此，你可以在很长一段时间内跟踪它们并对单个细胞进行成像，并研究它们的行为方式。光谱分离4Tune NDD检测器很棒，因为我们现在可以同时最佳地检测到所有染料。这对于想要追踪多种细胞类型或区别不同颜色标记的实验很重要。在我们的研究中，我们使用SP8 DIVE来同时研究干细胞和其多向分化，并可视化它们在同一组织中的行为方式。我认为，这对于我们今天和未来要解决的许多生物学问题都很重要。
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