本文带领大家走进HPLC的世界，先简单了解下HPLC的工作原理
1、HPLC分析流程图
现代HPLC一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。
最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统(目前基本上为色谱工作站，记录仪和积分仪已很少见)。
此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后衍生系统、样品收集系统和全自动控制系统等。下图是具有基本配置的HPLC的流程图。
HPLC的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理以及保存。
2、输液泵
高压输液泵是HPLC的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
3、脱气装置
流动相往往因溶解了氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪声峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则费时费力。
在荧光检测中，溶解氧还会导致发生荧光猝灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。
目前，HPLC流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。
4、梯度洗脱装置
在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰形较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。
在HPLC中流速(压力)梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，HPLC中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。
①线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。
②阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。
梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。
根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。
(1)高压梯度：也叫内梯度，一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种流动相至混合器，混合器是在泵之后，即两种流动相是在高压状态下进行混合的。
高压梯度系统的主要优点是：只需通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，仪器购买成本更高，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。
(2)低压梯度：也叫外梯度，只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵之前安装了一个电磁比例阀，流动相混合就在电磁比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压(低压)下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气机。来自于四种溶剂瓶的四条输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。
5、进样器
进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的HPLC所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器。
六通阀进样器有两种状态，分别是进样状态(Inject)和取样状态(Load)。
当手柄位取样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；
将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相色谱柱进行分析。
虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。
6、色谱柱
也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的，是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。
色谱柱的分类是依据填料类型而定。
正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 µm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。目前无定型基本上已退出市场。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 µm之间。
近年来出现了核壳色谱柱和整体色谱柱等新型填料，大大提高了色谱柱的性能。
7、检测技术
检测器是用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。
检测器有紫外检测器（UVD)、二极管阵列检测器（DAD或PDA）、荧光检测器（FLD）、示差折光检测器（RID或DRD）、蒸发光散射检测器（ELSD)、质谱检测器（MSD，一般称为液质联用）等。
8、数据处理系统与自动控制单元
(1)数据处理系统又称作色谱工作站。它可对分析全过程(分析条件、仪器状态、分析状态)进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。
(2)自动控制单元将各部件与控制单元连接起来，在计算机上通过色谱软件将指令传给控制单元，对整个分析实现自动控制、从而使整个分析过程全自动化。有自动控制单元的色谱软件也叫反控工作站。
也有的色谱仪没有设计专门的控制单元，而是每个单元分别通过控制部件与计算机相连，通过计算机分别控制仪器的各部分。
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