纯化应用专家
您身边的
Ä爱纯派
发送问题至akta.club@ge.com
48小时（工作时间）回复
上周三那场关于多步层析的在线分享，听说讲者都是行业大咖和技术专家，得到666无数。错过上线的小伙伴一直希望有干货分享，为此小编特地总结了出来，分享大家哦~
所谓自动化多步层析，是指初始样品上样后，经过全自动运行，直接得到经过两种或多种层析柱纯化的样品。通常第一步为亲和层析，第二步为经过优化的离子交换、脱盐或者凝胶过滤层析。
自动化多步层析的优势
省时省力：无需手动操作，节约时间成本和经济成本。
产物稳定：减少样品转移时间。
数据一致：减少人为干扰，实验方法重现性好。
在做多步层析的时候，根据您的自动化工作流程，可以在ÄKTA 系统上选择性的添加组件，如：四通阀和loop环阀可以将第一步的产物储存在loop环中用于第二步上样，第二个UV检测器可用于在流路的不同位置进行检测，第二个柱位阀可以帮助您实现最多10个柱子的自动化筛选等等。然后在UNICORN软件里利用Phase编程或者更加灵活的Text编程来完成一个您个性化的自动化多步层析流程。同时需要匹配好不同步骤的柱体积，确保各步骤之间可以良好的衔接。
在上周的分享中，两位行业大咖分别为我们展示了两个很棒的应用案例。
抗体的自动化两步层析
Jay Ye, PhD
美国再生药物公司Surrozen
高级科学家
纯化要求：
样品数量很多，但是每个样品的层析步骤都是Protein A加SEC，需要有scouting功能的两步纯化，减少手动操作的时间，且方法需要稳定持续。
自动化两步层析方案：
利用ÄKTA pure 25M的样品泵和样品入口阀实现第一步大体积上样，第一步的纯化产物收集到loop环阀上的loop环中，然后作为第二步的样品上样到SEC柱子。通过UNICORN软件的方法编辑功能，将两步层析写入同一个程序，自动化运行，同时也方便在该程序的基础上做scouting。
该自动化两步层析运行的结果如下：
通过scouting自动化的重复运行该程序，以实现高通量纯化。通过结果对比的一致性可以看出该方法具有很高的稳定性。
原本手动分别进行两步纯化，大约一天可以完成2-3个样品，而利用自动化多步层析，40ml的样品只需要100min即可完成两步纯化，即一天可以完成14个样品，大大提高了工作效率。
带有批量或在线稀释的自动化多步层析
Shin Isogai, PhD
巴塞尔大学Biozentrum分子生物研究中心 研究员
纯化要求：
上样量较大，样品数量多，且在各层析步骤之间需要稀释样品，希望通过自动化提高纯化的精确性和重复性。这是一个亲和层析加上离子交换的多步层析，只要能够解决步骤之间稀释样品的问题，即可参考上一个案例的方法实现自动化多步层析。
利用ÄKTA 系统来稀释样品有如下两种方式，一种是批量稀释，一种是在线稀释。经过测定，利用该方法在线稀释后的电导稳定性在±1%的偏差以内。
当把这两种稀释方式融入到自动化多步层析中，便形成了如下两种多步层析的方案：
1. 批量稀释多步层析
该方案需要在Pure 25M上配置7入口的IA、IB阀，多柱位阀，loop环阀，四通阀以及第二个UV检测器。
利用上述方案得到的层析结果在产率和纯度上和手动分步纯化相比基本没有改变，但是提高了自动化程度。
2. 在线稀释多步层析
当样品数量较多的时候，批量多步层析由于需要出入口的操作就无法满足了，此时我们可以选择在线稀释的多步层析方案。
该方案中，将两个IEX柱子接在loop环阀上，将Ni柱和AL亲和柱接在多柱位阀上，并且在多柱位阀前加一个UV检测器。通过样品泵进行常规的第一步Ni柱上样之后，将Ni柱的洗脱过程与通过样品泵的在线稀释过程同时进行，直接将第一步洗脱的产物进行了上样。
第二步IEX与第三步AL亲和之间无需稀释，因此两个串联的柱子同时完成了第二步IEX的洗脱和第三步AL的上样。此时多柱位阀前的第二个UV检测器可帮助实现每一步之后都检测到UV峰。
第三步AL亲和与第四步IEX之间的在线稀释以及衔接同第一步与第二步之间。
最后，按常规的IEX洗脱收集至收集器最终产物。
通过如上方案，可以得到连续4步层析的图谱，并且在这个过程中不需要储存中间产物。
对比手动分步层析、批量稀释多步层析以及在线稀释多步层析三个方案，可以明显的看出，连续的在线稀释自动化多步层析可以将手动劳动力的时间缩短至原来的1/6，并且实现更多样品数量的自动化层析。
是不是意犹未尽？请持续关注我们哟，还会有更多有趣的内容上线~
首页
