应对AAV衣壳蛋白分析挑战，有新招！

为确保药品的安全性和质量，在基因治疗产品的整个开发过程中，需要对AAV衣壳的结构、性质及其蛋白质组成进行充分表征和监测。传统分析技术如ELISA、免疫印迹法或SDS-PAGE等常用于确定功能和组成信息，但这些技术存在难以部署和验证或对AAV血清型检测不灵敏等问题。因此，迫切需要一种耐用且能及时提供可靠结果的专属方法来鉴定和表征AAV衣壳蛋白。

图1. AAV示意图，其结构由蛋白质衣壳和衣壳中包裹的基因组成

AAV衣壳由三种病毒蛋白（VP1、VP2和VP3）组成，其比例、鉴别、纯度影响药物效能和效价强度，需要被鉴定并监控以确保药物质量。质谱分析法（MS）由于具有良好的灵敏度和专属性，已被广泛应用于蛋白质结构分析。

图2. LC-MS分析衣壳蛋白面临挑战

BioAccord系统是基因治疗产品开发和商业化团队获取rAAV衣壳结构、组成和鉴定信息的理想选择，包括在符合法规要求的waters_connect信息学平台上运行，能够自动、高重现性地完成色谱分离和准确质量数测定等工作。

沃特世应用科学家开发了UPLC-光学检测方法和UPLC-MS方法分析AAV完整衣壳蛋白，将其应用于AAV8血清型分析，作为改善衣壳蛋白表征（包括鉴定、化学计量数和翻译后修饰）的案例研究，并将此方法用于其它rAAV血清型，证明该方法在对AAV载体进行完整蛋白质分析方面具备普适性。

AAV衣壳中VP1、VP2和VP3比例约为1:1:10，质量范围介于50~85 kDa之间。由于样品量有限且蛋白质的相对丰度存在差异，因此传统LC-MS方法难以表征AAV衣壳蛋白。

图3. 以AAV8为例展示衣壳蛋白组成示意图

通过优化流动相和色谱柱，色谱分离度明显提升（图4），有利于对各VP蛋白进行详细的MS分析（图5A）。上样0.5 μg AAV8时，测得了全部衣壳蛋白及其变体的MS数据（图5B–E）。

如下表1所示，相关蛋白质的实测质量数与VP1、VP2和VP3的理论质量数一致，证明所开发的方法适用于病毒蛋白质量数测定。

表1. 根据图5A中分离峰的理论平均质量数确定的AAV8衣壳蛋白归属结果

此外，测定变体的准确质量数有助于对VP上潜在的翻译后修饰（PTM，包括乙酰化和磷酸化）进行归属，同时也能够证明VP1和VP3上去除了N-端甲硫氨酸。结果表明，9.38 min处后流出峰的质量数为50,592 Da，与VP3上不稳定的Asp659-Pro660键水解后所产生碎片的MW匹配。上述结果共同证明了该方法在AAV相关产品的开发性表征方面的能力。

本研究分析了六种来自不同供应商的AAV血清型（1、2、5、6、8和9）。图6表明，上述AAV血清型中多数（AAV1、AAV6、AAV8和AAV9）具有类似的色谱图。此外，还观察到VP3峰出现前延肩峰，且质量数与VP3相同, 可能是VP3的结构异构体。在所有AAV血清型中均观察到VP1和VP2发生磷酸化，VP1和VP3发生乙酰化。

图6.  6种AAV血清型的分离结果

虽然本研究开发的方法能够有效分离多数AAV血清型，但AAV2和AAV5样品的分离色谱图出现差异。观察到AAV2的VP1和VP2发生了共流出（图6B），此时可能需要采用更加平缓的梯度才能使色谱峰完全分离。血清型AAV 5（图6C）的VP色谱图与AAV2类似，但是6.95 min处色谱峰的去卷积质谱图中未显示VP1。该异常现象提示需要尝试其它实验条件以改善分析效果。图6G展示了经过优化的梯度条件下分析AAV5样品所得到的总离子流色谱图。使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱后，VP1蛋白的回收率明显提升，且在VP3后流出（图6G）。流出顺序的变化表明AAV5中VP1的疏水性较高，这一点也可以通过其氨基酸组成中疏水残基（如脯氨酸和苯丙氨酸）数量较多得到证实。综上所述，所开发的LC-FLR/MS方法能够对基因治疗方法开发过程中多种常见AAV血清型的rAAV衣壳蛋白进行有效测定。

表2. 根据理论平均质量数和标注的修饰对6种AAV血清型的衣壳蛋白进行归属

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