近来使用腺相关V病毒(AAV)作为基因治疗中递送ssDNA的有效载体持续热门，这一成功的一个主要原因是一系列血清型AAV具有广泛的组织亲和性。迄今为止，已鉴定出大约13种不同的血清型，其具有一系列共享的氨基酸序列特征。在结构上，病毒衣壳是由三个衣壳或病毒蛋白(VP)组成的60蛋白二十面体，以1:1:10的比例(VP1:VP2:VP3)非共价组装。
这三种蛋白具有高度的序列同源性，因为VP2和VP3代表VP1蛋白的迭代N端截断。得到的近似质量分别为VP181kDa、VP266kDa和VP360kDa。鉴于血清型和结构蛋白序列相似性，蛋白鉴定、相对蛋白比例和翻译后修饰评估至关重要。然而，由于完整衣壳的质量范围从3.67MDa(对于空衣壳)到4.75MDa包含其有效载荷(高达4.7kbssDNA)的衣壳，因此在检测之前需要将衣壳变性和解离。
在本应用中，我们通过使用Biozen® Intact XB-C8反相柱，进行LC-MS，分析了AAV5和AAV9的变性和解离衣壳蛋白。值得注意的是，尽管衣壳结构内不存在共价结合物，但不还原的变性可以导致AAV9中VP1和VP2形成共价复合物。
Sample Preparation
LC Conditions
Column: Biozen 3.6μm Intact XB-C8
Dimension: 150x2.1mm
Part No.: 00F-4766-AN
Mobile Phase:
A: 0.1% Trifluoroacetic Acid in Water
B: 0.1% Trifluoroacetic Acid in Acetonitrile
Gradient:
Time(min)
%B010310
3.1
35
7.1
35
21.94
65
22.04
90
25.04
90
24.14
10
29.14
10
Flow Rate: 0.3mL/min
Injection Volume: 5μL
Temperature: 60℃
Instrument: Vanquish™ UHPLC
Detection: MS
Detector: Q Exactive™ Orbitrap™ Plus
MS Conditions
Scan Type: Full MS
Resolution: 70,000
AGC Target: 3e6ms
Maximum IT: 200ms
Scan Range: 200 to 2000m/z
Scan Type: MS2
Resolution: 70,000
AGC Target: 1e5ms
MaximumIT: 200ms
图1 AAV5衣壳蛋白醋酸变性的总离子色谱图，浓度为3.2E12vg/mL(约98ng protein)
图2 AAV9衣壳蛋白醋酸变性和Tris (2-carboxyethyl) Phosphine还原的总离子色谱图，浓度为3.2 e12vg/mL(约92ng Protein)
图3 AAV9衣壳蛋白用甲酸变性和Tris (2-carboxyethyl) Phosphine还原的总离子色谱图，浓度为3.2E12vg/mL(约92ng Protein)
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