东曹两步层析法平台，降低单克隆抗体下游纯化工艺成本

东曹分离与纯化

2020.8.28

作者东曹

TA的动态

在生物医药领域，下游工艺占生物制剂整体生产成本高达80%。鉴于目前正在努力降低生物制剂的生产成本，色谱工作者和纯化工艺工程师有必要对下游工艺进行精简。

本篇推送中，我们将展示与标准工艺流程相比，东曹两步层析法在纯化单克隆抗体方面的优势。结合高性能Protein A填料的捕获能力和耐盐阴离子交换填料的精纯步骤，我们可以将下游成本降低45%，并同时将产量提高58%。

材料和方法

层析填料

TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F是用于纯化mAb的高载量Protein A填料。其动态结合载量 (DBC) 为70 g/L (保留时间5分钟）。

TOYOPEARL NH2-750F是一种聚甲基丙烯酸树脂骨架，官能团为伯胺基的耐盐型阴离子交换填料，非常适合mAb和其他蛋白质的中间纯化，可以有效去除DNA、病毒、宿主细胞蛋白 (HCP) 和内毒素之类的杂质。另外，由于pKa值相对较低(介于7-9之间)，NH2-750F也能有效去除mAb多聚体。鉴于该独特的性质，去除几乎所有杂质通常所需的两步纯化(中间纯化+精纯) 可以合并为一步流穿模式完成精制。

预装柱

所有实验均采用了SkillPak 5 mL预装柱。该类层析柱专为快速开发方法或筛选填料设计，不仅性能卓越、稳定可靠，还可以与常用的低压或中压液相层析系统配合使用。它们不仅能够重复填装，还充分考虑了每种填料不同的耐压及压缩比参数。因此，能够精确展示各种规模尺寸层析柱中的代表性性能指标。

纯化工艺的开发

工艺开发

前期工作中，我们优化了TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F捕获抗体的能力。捕获后，通过将洗脱物在低pH下保持1小时进行病毒灭活步骤。

针对耐盐阴离子交换填料TOYOPEARL NH2-750F的第一个实验，是在pH 8.0的线性梯度下使用结合-洗脱模式确定流穿模式所需的电导率。

由于单抗单体会首先被洗脱，我们优化了流穿模式下的层析条件。在流穿实验中，我们使用的电导率为20～25 mS/cm，原因是该条件下仅会洗脱出单抗单体，而二聚体及多聚体仍与填料保持结合状态。为了省去后续层析步骤并直接获得目标纯度，我们为该平台方案设计选择了20 mS/cm的电导率。相应的层析谱图如下所示。

▲在SkillPak上进行mAb流穿模式精纯的层析谱图

纯化平台

现在将两个层析步骤合为一个完整的工艺流程，包括中间通过低pH保持进行病毒灭活步骤。Protein A捕获这步的回收率为98.8%，AEX这步的回收率为91.3%，因此总回收率为90.2%。DNA、HCP和脱落的Protein A配基均去除至限定范围内。下表列出了该两步层析平台的关键质量属性。

▲东曹两步层析平台的关键质量属性

工艺成本分析

我们使用了BioSolve生物工艺分析软件，对比了东曹两步层析工艺的下游成本与BioPhorum Operations Group发布的行业标准工艺成本。分析结果表明，经过优化的东曹两步层析法平台工艺每克mAb的成本比标准工艺低45%。此外，由于省去了一步层析，并且东曹填料可以在更高流速下使用，工艺流程时间也减少了58%。