APGC助力解决生物样品中脂肪酸定量难题

沃特世

2020.10.22

作者沃特世

TA的动态

脂肪酸是细胞膜重要组成部分和能量来源，且和多种生理过程的信号传导密切相关。短链脂肪酸在葡萄糖代谢和胰岛素抵抗中具有关键作用。多不饱和脂肪酸作为类二十烷酸的重要前体，与多种炎症疾病相关。

GC-MS分析方法

GC-MS分析方法凭借其良好的分离度和峰容量，已成为脂肪酸的广泛分析方法。为了增加脂肪酸的挥发性和热稳定性，甲基酯化是GC-MS分析脂肪酸常用的衍生方法。但是脂肪酸甲酯（FAMEs）在EI源（GC-MS常用的硬电离源）中非常容易碎裂，这会降低FAMEs的灵敏度。而基于碎片离子峰的脂肪酸的定量分析，会因为多个碎片峰以及碎片峰多来源问题，导致假阳性存在，尤其在复杂基质中更为严重。

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沃特世的大气压气相色谱电离源(APGC)，作为一种软电离技术，可得到很强的分子离子峰，增强定量的灵敏度和选择性，可成功用于脂肪酸的定量分析。

实验流程

采用甲苯/甲醇-d0和甲苯/甲醇-d4分别衍生脂肪酸标准品（C4-C24）作为分析物和内标（衍生策略见图1）。

图1：生物样品中脂肪酸定量策略（A）和衍生机理图（B）

随后用沃特世APGC串联SNAPT G2-Si QTOF质谱仪对其进行分离、定量分析，分离色谱图见图2。

图2：APGC-QTOF/MS检测30种脂肪酸标准品（A）,WT（B）和fat-1小鼠（C）脑组织中脂肪酸的色谱图

该方法用于定量fat-1转基因和野生型（WT）小鼠的大脑和肝脏组织中的脂肪酸。组织样品在经过甲基叔丁基醚/甲醇溶液提取后，采用甲苯/甲醇进行甲酯化衍生，然后用APGC-QTOF/MS进行分析，检测结果见图2B-C。

结果表明

fat-1转基因小鼠能够编码n-3 PUFA去饱和酶，该酶将n-6 PUFA转换为n-3 PUFA，导致组织中n-3 PUFA升高以及n-6 PUFA含量降低。因此，小鼠fat-1的基因修饰大大影响了脂肪酸的轮廓，包括磷脂。如预期，该实验中fat-1小鼠的n-3 PUFA含量显着增加，包括ALA，二十碳三烯酸，EPA，DPA和DHA。且相对于WT小鼠，fat-1小鼠肝脏组织中所有n-6 PUFA（例如亚麻酸和AA）的水平均降低。除了无法检测到的ALA和EPA，这些变化在脑组织中相似。fat-1的基因修饰显着增加了脑和肝组织中的总n-3 PUFA，减少了总n-6 PUFA，以及n-6与n-3 PUFA的比例。

对fat-1和WT小鼠脑和肝组织中检测脂肪酸进行多元统计学分析（见图3）由OPLS-DA图结果可知，fat-1和WT小鼠分为明显两组，并结合S-plot图，在脑或肝样品中选择了八种n-6或n-3 PUFA生物标记物用于fat-1小鼠的基因修饰。

图3：fat-1和WT小鼠脑（A）和肝组织（B）中磷脂脂肪酸的OPLS-DA得分图（左）和对应的S-plot图（右），差异性脂肪酸标志物（VIP>1,p<0.05）在S-plot图中标记为红色

数据显示，转基因fat-1基因可提高组织中n-3 PUFA的水平，同时降低组织中n-6 PUFA和n-6 / n-3的比率，这表明fat-1小鼠是阐明n-3 PUFA或n-6/n-3比值在各种疾病机理研究的理想动物模型。

总结

在该研究中，开发了一种灵敏而准确的方法，通过化学同位素标记结合APGC/Q-TOF MS分析定量生物样品中的磷脂脂肪酸。通过提供一对一的标记内标，证明这种标记策略可有效准确定量30种脂肪酸（C4-C24）。该方法成功用于测定fat-1和WT小鼠脑和肝组织中的磷脂脂肪酸，还可扩展以定量生物样品或其他基质中的游离脂肪酸或其他结合脂肪酸。

APGC技术不仅可以和高分辨质谱联用，将一台液相色谱-高分辨质谱联用仪，转化为气相色谱-高分辨质谱联用仪，也可以和三重四极杆质谱联用。因此实验室仅需2台质谱，即可实现4台仪器（GC-QQQ，LC-QQQ，GC-HRMS，LC-HRMS）的功能，从而扩展更多功能，并且节省成本。