RIN 值与 RNA 完整性检测之间有何关联？
要想做好 RNA 测序的样品质控，单看 RIN 值是否已足够？
有时明明 RIN 值很高，为何有些位点就是怎么也测不到？
研究小 RNA 的差异表达时，RIN 值是否具有参考价值？
疑问太多，找不到答案？莫着急，跟随行业大牛、技术领头人— 华大科技，通过重要文献解答和实战经验分享，了解 RIN 值的正确打开方式以及不同应用中 RNA 的质控方法，轻松攻克应用难题。
RNA 完整性常用参数— RIN 值
RIN 值是安捷伦科技公司开发的以数字化形式表示 RNA 完整性的参数。
RIN 值相比核糖体 18S:28S 的结果可信度更高
RIN 值反映总 RNA 的完整性，与样本浓度无关
RIN 是基于以人、小鼠、大鼠为代表的哺乳动物开发的
图 1. RIN 值比 18S:28S 更可靠，不受样本浓度的影响。图中原始样本的核糖体 CV 为 5.1%，RIN 值为 8；将样本梯度稀释后，核糖体 CV 变为 22%，而 RIN 仍为 8，说明 RIN 值的稳定性明显优于核糖体比值。
RNA 的质量受多因素的影响
Ambion 的操作手册中讲到，RNA 的完整性对 GLOBIN 清除步骤以及下游应用的成功至关重要，即使是中等水平的 RNA 降解也会导致捕获试剂在清除球蛋白 mRNA 时的不充分
血液样本的保存、RNA 纯化的方法以及残留 RNA 酶的活性都会影响 RNA 的质量
为保证 RNA 的质量，Illumina 的产品手册中要求 RIN 值要大于 8，华大根据交付样本的大数据分析，建议交付的样本的 RIN 值大于 7（关于 RIN 值的标准，用户可以根据现实研究经验进行设定）
RIN 值可结合 RT-PCR 来对用于表达谱的 RNA 进行质量评
为了研究如何将全国各地的样本安全送到样本库而免受人为因素的干预，挪威公众健康中心除了对合适的采血管、最佳/次优的采血体积进行讨论以外，还分析了来自全国各地样本的表达谱差异1：
通过 RIN 分析总 RNA 的完整性
对 6 个有代表性的与癌症发生相关的基因进行 RT-PCR 并分析其转录本的变化
研究结果是 RNA 质量未受运输过程的影响，关键基因的转录本的表达模式没有发生显著变化
这种通过 RIN 值检测 RNA 完整性，结合 RT-PCR 检测关键基因转录本稳定性的方法，可以更全面的评估 RNA 的质量，特别是可用于研究样本是否适用于下游表达谱。
融合基因检测时，除了 RIN 值，还要考虑融合位点与 3’ 端的距离
慢粒白血病的靶向药格列卫靶向融合基因 BCR-ABL 因前段时间热映的影片《我不是药神》而走入大众视野中。有研究表明在 BCR-ABL 阳性患者中有不到80%的患者同时也存在 ABL-BCR 融合。在梅奥诊所的研究中提到，当样本 RIN 值为10时，测序可以同时检测到两种融合产物，而当 RIN 值为 7 以下时就检测不到 BCR-ABL 了2。
从梅奥诊所的这项研究结果可以推断出两个融合位点距离 3’ 端是有差异的，而事实上的确如此，BCR-ABL 距离 3’ 端 5kb，ABL-BCR 融合距离 3’ 端只有 1.5kb（图 2, b）。将整个测序数据平铺在转录本上，横坐标是融合位点与3’末端的距离，纵坐标是覆盖的reads深度。结果显示：
只有当 RIN 值为 10 时，几乎可以实现对距离 3’ 端 0-5kb 区域的均匀覆盖（图 2, c）
一旦 RIN 值小于 10，就很难覆盖到距离 3’ 端大于 2kb 的区域了（图 2, c）
当 RIN 为 3 时，即使距离 3’ 端 1.5kb 的 ABL-BCR 也不能被很好的覆盖（图 2,d ）
梅奥同时指出：
人癌症变异（COSMIC）数据库中，目前已知的融合基因产物的融合位点距离 3’ 端的中位数为 2.7kb，大约有 20% 融合位点距 3’ 端大于 5kb、5% 距 3‘ 端大于 7kb
RIN 值小于 10 时，难以测到距离大于 2kb 的融合位点。也就是说当 RIN 值小于 10 时，至少有超过 20% 的融合基因的产物无论测多少深度都是测不到的
融合位点的成功检测基于两个因素：RIN 值、融合位点与转录本 3’ 端的距离
图 2. 从这张 PPT 里可以看出，距离转录本 3’ 端更近的 ABL-BCR 更容易被检测到；只有当 RIN 值为 10 时，可以对距离 3’ 端 1-5kb 区域实现均匀覆盖；当 RIN 值小于 10，就很难覆盖到距离3’端大于 2kb 的区域。
在以 PolyA 钓取为主要技术手段研究编码 RNA 时，RIN 只能做为评估基本样本完整性的方法，而不能预测表达谱数据的可信度
在两组独立的实验中，实验 1 将人标准参照（ UHR ）处理成不同RIN值的梯度，针对不同基因位点的测序结果做散点检测，分别以基因位点距转录本3’端的距离和检测灵敏度（有效 reads 数）作为横坐标和纵坐标3。结果发现 RIN 值相同（7.5）的两个不同样本在做散点图时，一个的曲线更拟合于 RIN 值为 8.6 的 UHR，另一个更拟合于 RIN 值为 5.9 的 UHR 样本（图3）。实验 2 对健康志愿者的外周血分离单核细胞进行研究，在室温下静置不同时间（形成不同降解程度），纯化后进行以 PolyA 为技术手段的转录组测序4。对结果进行聚类分析，维度一为处理方案，即静置时间，维度二为样本的 RIN 值。在聚类结果中发现，聚类依据更多的与样本处理方案相关，而非 RIN 的差异（图 4）。
从这两份研究中得到的结论是：
1．RIN 值可以作为评估基本样本完整性的方法，但不能预测某一个特定基因的完整性，这种情况下测序数据是样本完整性较为客观的反映
2．在大多数情况下 RIN 值不能预测表达谱数据的可信程度
3．表达谱数据的改变与取样方式、保存方法以及提取方法之间有着显著的关系
4．研究人员最好能够配合多种方法学的验证，以得出更准确的实验结论
图 3. 两个 RIN 值相同的不同样本，它们的表达谱数据与标准对照的聚类结果并不相同。
图 4. 转录组测序的聚类结果与样本的RIN值并没有呈现出显著的相关性。
RIN 值低的样本也可以用于小 RNA 的测序
加拿大的研究者在严格控制的实验环境下（没有核酸酶污染），以不同起始量的总 RNA 构建测序文库，并对总 RNA 进行处理，获得 RIN 值从 9-2 的样本5。测序结果表明：
1．RNA 测序鉴定到的小 RNA 的数目与建库时所用的起始总 RNA 量没有显著关系
2．RNA 测序数据的可利用程度（用于鉴定小 RNA ）与 RIN 值没有显著关系
3．以全血为实验材料时，小 RNA 具有极高的稳定性，样本 RIN 值低也可以做小 RNA 测序，并且小 RNA 的定量结果是很可靠的
另一项研究发表在 Nature Biotechnology 上，研究者在全美选择了 9 个技术过硬的实验室，用4家主流的 RNA-Seq 试剂盒（实验方案），对体液的小 RNA-Seq 结果展开对比6。图 5 中，三百多条合成序列（浓度设定已知）分为 A 组和 B 组。结果显示：
1．聚类的结果只与建库的方法有关，如果建库方法不同则同一实验室同一样本的结果也不一致
2．当只关心小 RNA 的差异表达时，最右侧的结果显示不同方法与实验室之间具有很好的可比性
3．当以血清样本替换合成样本时，结果一致。说明以血清为代表的液体活检，当只关注小 RNA 的差异表达时，结果具有很好的重复性和再现性。
图 5. 结果显示，相同的实验方法之间更强的相关性；与之相对的是，当分析 A 与 B 的相对值时，使用相同实验方法的不同实验室显示出非常高的相关性，并且即使在不同方法间也显示出高度的相关性。这说明相对定量对实验方法的差异有更好的包容性。
FFPE 样本的质量评估
Illumina 推荐使用 DV200 来评估 RNA 是否可用于转录组测序，他们认为 DV200 大于 30%，即总 RNA 中大于 200nt 的组分占比大于 30% 时是可以用于转录组测序的。
针对不同完整性的 FFPE 样本，我们可以通过选择不同的实验方案来实现对样本内核酸信息的最大限度挖掘
诺华制药生物医学研究所针对不同样本用量、不同降解程度以及不同 RNA 实验方法设计了一个宏大实验方案，用于评价最优的建库方案（图 6）7。基本从五个维度进行了全面的评价：
1. 能否产生高质量的测序数据
2. 对于已知转录本是否能够实现全长的覆盖
3. 能否检出非编码的 RNA 序列（这对于医学研究特别重要）
4. 对于已知的基因，其定量的结果是否准确，例如与 QPCR 的方法或其它方法学的结果相比较
5. 当使用不同的样本量、降解程度时，其定量结果是否是可再现的
这篇文章的结论是：在应对不同起始量、不同 RNA 完整程度的样本时，不同的建库方案都有各自的优缺点；但针对不同完整性的样本，我们可以通过选择不同的实验方案来实现对样本内核酸信息的最大限度挖掘。文章提到，当使用 TruSeq 的建库方法，即使样本只有 5ng 时，其测序结果也不错；而对于严重降解的样本，文章认为 Access 的方法可能是更好的选择。
图 6. 对不同样本用量和降解程度的样本，以三种不同实验方案进行 RNA 测序，得出的比较结果与建议。
希望以上这些华大专家的建议和安捷伦对 RNA 质控的经验与理解，可以帮助您更好的应用与实践二代测序 RNA 完整性检测。
参考文献：
1．Duale N, et al. Human blood RNA stabilization in samples collectedand transported for a large biobank. BMC research notes. 2012;5:510.
2．Jaime I, et al. The impact of RNA degradation on fusion detection byRNA-seq. BMC Genomics. 2016; 17: 814.
3．Winters JL, et al. Development and Verification of an RNA Sequencing(RNA-Seq) Assay for the Detection of Gene Fusions in Tumors. J Mol Diagn. 2018 Jul;20(4):495-511.
4．Gallego Romero I, et al. RNA-seq: Impact of RNA degradation ontranscript quantification. BMC Biol. 2014 May 30;12:42.
5．Lopez JP, et al. Biomarker discovery: quantification of microRNAsand other small non-coding RNAs using next generation sequencing. BMC MedGenomics. 2015 Jul 1;8:35.
6．Giraldez MD, et al. Comprehensive multi-center assessment of smallRNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):746-757.
7．Schuierer S, et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocolsfor degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 2017 Jun 5;18(1):442.
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