北大研究人员都在做的分析——RNA velocity

scRNA-seq可以高准确度、高灵敏度和高通量来揭示RNA丰度。但它的一个主要缺点是它仅捕获某个时间点RNA丰度的静态快照，无法直接揭示细胞分化等动态过程。因此拟时分析逐渐在探究细胞分化机制中扮演重要角色，其中一个方法是RNA velocity分析。RNA速率分析可以让我们预测单个细胞未来的基因表达。通过比较含有内含子的前体mRNA (unspliced)和不含有内含子的成熟mRNA（spliced）的相对含量来分析mRNA的剪接和降解速率，spliced mRNA丰度和unspliced mRNA丰度的动态与平衡可以用来预示细胞转录状态的动态变化。

RNA velocity分析与monocle等软件对比，有一定的优势，一是他代表的是细胞在某一刻的潜在分化方向，而不是一条连贯的细胞轨迹，所以无需运用生物学的先验经验来在分析中指定起点和终点；二是他的数据兼容性强，结果数据以高维数据存储，可以嵌入到tSNE、UMAP降维分布图和monocle、PAGA构建的细胞轨迹中，因此他能与其他拟时分析结果相互印证。

肝癌（HCC）的免疫微环境特征不明显。结合两种单细胞测序技术，作者产生了HCC患者CD45+免疫细胞的转录组，这些细胞来自五个免疫相关的部位：肿瘤、邻近的肝脏、肝脏淋巴结（LNs）、血液和腹水。一组LAMP3+树突状细胞（DCs）似乎是传统DC的成熟形式，并具有从肿瘤迁移到淋巴结LNs的潜力。

癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水五种组织的CD45+免疫细胞。

肿瘤微环境中的树突状细胞，传统上分为cDC1和cDC2，此研究除了鉴定出DC-c1-

CD1C（传统cDC2）和DC-c3-CLEC9A（传统cDC1），还发现了一种有别于经典DC分类的LAMP3+DC（图1）。结合肺癌，乳腺癌单细胞数据，发现LAMP3+DC似乎存在于多种肿瘤类型中并且可以通过scRNA-seq检测到。

图1：热图显示基于SMART-seq2的HCC中DCs的基因表达；行代表标志性基因，列代表单个细胞

进一步研究LAMP3+ DCs与其他DC亚群之间的关系，作者做了体外实验，用LPS+IFNg或poly I:C刺激细胞成熟，发现体外刺激下，所有三个DC亚群上调了LAMP3。然后作者对体外刺激前后的DCs进行了scRNA-seq分析，以描述DCs亚群在LAMP3+DCs形成过程中的转录组变化。这些DCs可以分为10个亚群（图2A）。其中，C02和C03被确定为cDC2，C01和C04为pDCs，C08为LAMP3+ DCs，还发现C05是一个新定义的CDC亚群，AS-DC（AXL+DAB2+)。此外，作者发现有三个集群在体外刺激处理后的样本（也就是成熟DCs）中富集：C07对应于从cDC2到LAMP3+ DCs之间的过渡阶段，在刺激细胞成熟后更突出；C09和C10对应于从pDCs到LAMP3+ DCs之间的过渡阶段，在刺激细胞成熟后的样本中更突出（图2B）。这些都表明LAMP3的表达是多种DC亚群的成熟标志物。

图2

A. UMAP图显示体外DCs的分群。每个点代表一个单细胞，颜色代表集群

B. 体外DC亚群的比例，不同颜色代表不同亚群，X轴代表不同体外刺激，Y轴代表不同集群的比例

为了进一步研究LAMP3+DC与其他DC亚群的谱系关系，作者对HCC中的DC亚群进行了RNA速率分析，观察到1.5%的cDC1和0.98%的cDC2有可能转变到LAMP3+ DCs （如图3A），表明LAMP3+ DCs在肿瘤中可能来源于cDC1和cDC2。对于体外刺激过后的DC亚群，RNA速率分析显示在过渡期的细胞（C07和C09）呈现出一种强的朝向LAMP3+DCs的方向性流动（如图3B），表明体外成熟刺激诱导LAMP3+ DC从cDCs和pDCs分化而不是AS-DCs。因此，体外和体内的结果都证明了不同的原始DC亚群有潜力成为LAMP3+ DC。

图3

A. RNA速率在HCC中DCs的扩散图投影上可视化

B. 使用在规则网格上的高斯平滑法把RNA速率在UMAP投影上可视化

接下来为了研究HCC中DC的迁移潜力，在进行一些侵袭迁移实验后，作者还进行了RNA速率分析来检查DC迁移方向，并且观察到cDC1和cDC2在肿瘤和LNs淋巴结之间没有表现出明显的方向性流动。相反，在LAMP3+ DCs内，肿瘤来源的细胞表现出向淋巴结的方向流动，有明显高于cDC1和cDC2的倾向性，进一步为LAMP3+ DCs的潜在迁移方向提供证据（图4）。

图4

A. RNA速率在体外DCs的UMAP投影上用高斯平滑法在规则网格上可视化

B. 肿瘤中的LAMP3+ DCs表现出从肿瘤到淋巴结的RNA速度连接的高比例（Fisher''s确切检验）

总的来说，作者在HCC中发现了具有成熟特征的LAMP3+ DCs，这些DCs可能起源于cDC1和cDC2，并表现出向LNs淋巴结迁移的能力。

通过以上案例，我们可以发现在比较庞大的分析中，RNA velocity分析主要作为一个辅助工具来揭示分化轨迹以及分化起源和迁移方向，为后续分析奠定基础，帮助验证实验结果。希望这次分享能为老师们提供思路，用RNA velocity分析为研究锦上添花。

【参考文献】

1.La Manno, G., Soldatov, R., Zeisel, A., Braun, E., Hochgerner, H., Petukhov, V., Lidschreiber, K., Kastriti, M. E., Lönnerberg, P., Furlan, A., Fan, J., Borm, L. E., Liu, Z., van Bruggen, D., Guo, J., He, X., Barker, R., Sundström, E., Castelo-Branco, G., Cramer, P., … Kharchenko, P. V. (2018). RNA velocity of single cells. Nature, 560(7719), 494–498. 

2.Zhang, Q., He, Y., Luo, N., Patel, S. J., Han, Y., Gao, R., Modak, M., Carotta, S., Haslinger, C., Kind, D., Peet, G. W., Zhong, G., Lu, S., Zhu, W., Mao, Y., Xiao, M., Bergmann, M., Hu, X., Kerkar, S. P., Vogt, A. B., … Zhang, Z. (2019). Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell, 179(4), 829–845.e20.